• 미생물학회지
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• 제36권1호
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• pp.14-19
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• 2000

Penicillium oxalicum(HCLF-34)의 세포외 분비효소로부터 ultrafilration, gel filtration chromatograph와 anion exchange chromatography법을 이용하여 남조세균(Anabaena cylindrica) 분해효소를 분리하였다. 이 효소의 분자량은 약 22 kDa이며, renaturation SDS-PAGE에서 monomer로서 남조세균 분해 활성을 갖는다. 아미노산 서열은 N-말단부터$NH_(2)$-Glu-Ser-Tyr-Ser-Ser-Asn-Ala-Ala-Gly-Ala-Val-Leu-Ile---, 13개의 아미노산을 분석하였으며, 분석된 아미노산의 homology를 조사한 결과 aspergillopepsin II precursor(acid protease A)와 13개의 아미노산 중 11개(84%)의 유사도를 나타내었고, acid proteinase EapC precursor과 13개 중 10개(81%)의 유사도를 나타내었다.

• 미생물학회지
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• 제35권3호
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• pp.231-236
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• 1999

Penicillium oxalicum 으로부터 세포외로 분비되는 Anabaena cylindrica 분해효소의 분자량은 renaturation SDS-PAGE에서 약 22kDa 으로 확인되었으며, 분해 효소의 농축은 ultrafiltration cut off fraction 중 30-10 kDa 구간에서 수획하였다. 최적 활성조건의 측정 결과 적정 pH는 3.5-4.0, 적정반응 온도는 $20^{\circ}C$, 그리고 온도 안정성은 $4^{\circ}C$ 이하에서 100% 이상, 20-$90^{\circ}C$ 범위에서는 50% 이상의 활성을 나타내었다. 금속이온 및 효소안정제의 영향에서는 $Na^+$,$K^+$, $Ba^(2+)$, $Mg^(2+)$, $Mn^(2+)$의 양이온과 BSA는 효소의 활성을 촉진시키는 반면, $Ca^(2+)$, $Cu^(2+)$의 양이온과 EDTA, PMSF 는 효소의 활성을 억제하는 작용을 하였다. 이러한 금속이온과 안정제의 영향에서 1가, 2가 양이온에 의해 활성이 증가하고, $Fe^(3+)$, $Ca^(2+)$, $Cu^(2+)$의 양이온에 의해서는 활성이 감소하는 결과는 대부분의 세포벽 분해효소가 갖는 특성과 유사한 결과였다. 분해효소는 A. cylindrica 과 Micrococcus. luteus 의 세포벽을 기질로 사용한 효소의 활성 반응에서 반응 시작 후 1시간에서 5시간 사이에 반응 산물로 환원당의 양이 급격히 증가하였다.

• 생명과학회지
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• 제12권4호
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• pp.483-489
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• 2002

S. cerevisiae에서 glucoamylase 유전자의 promoter와 signal sequence 그리고 MF$\alpha$1의 prosequence를 이용하여 합성 곤충 defensin를 발현하고 항균활성을 보유한 형태로 분비하는데 성공하였다. Defensin의 여러 생화학적인 특성을 조사한 결과 열 안정성이 높아 10$0^{\circ}C$에서 30분간 가열하여도 항균활성을 온전히 유지하였으며 조사한 pH 영역, 2.0-12.0에서 항균활성의 변화가 없었다. 또한 여러 단백질 분해효소를 처리하면 항균활성이 완전히 사라졌으나 전분질 분해효소, 섬유소분해효소 및 지질분해효소의 처리는 항균 활성에 전혀 영향이 없었다. 황산암모늄침전, SP-Sepharose column cormatography, RP-HPLC 등의 조작을 통해 defensin을 순수한 형태로 정제하였으며 Tricine-SDS-PAGE를 통해 분자량이 약 4.0 kDa임을 확인하였고 정제한 defensin은 항균활성을 보유하였다.

• 한국식물병리학회지
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• 제12권1호
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• pp.1-10
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• 1996

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria의 감염으로 토마토 잎조직에 $\beta$-1, 3-Glucanases와 chitinases가 합성, 축적되었다. 그러나 접종되지 않은 건전한 잎에서는 위의 두 가지 가수분해 효소는 매우 낮은 수준으로 유지되었고, 이 두 가지 효소는 친화적 상호작용에서보다는 불친화적 상호작용에서 더욱 높은 수준으로 존재하였다. 이것은 $\beta$-1, 3-glucanases와 chitinases가 X. c. pv. vesicatoria의 생육에 대한 방어기작으로서 중요한 역할을 한다는 것을 시사해 주고 있다. Native PAGE 젤 상에서 $\beta$-1, 3-glucanases를 분리한 결과, 병징 발현이나 저항성 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되는 산성 isoform Ga 1과 염기성 isoform Gb 1의 isoform bands만 확인되었다. Isoelectric focusing을 이용하였을 때, 적어도 pI 6.4와 pI 8.6을 지닌 두 개의 $\beta$-1, 3-glucanases의 isoform을 확인할 수 있었고, 특히 불친화적 상호작용에서 더욱 뚜렷하게 유도되었다. 이것은 병 진전과정에서 X. c. pv. vesicatoria에 대해 저항성 발현에 관여한다는 것을 나타내고 있다. 산성 chitinase isoform인 Ca 1의 활성은 병원균의 감염이 진전되는 동안 감소하였다. 또한 다섯 개의 염기성 chitinase isoform이 감염된 토마토 잎 조직에서 발견되었는데, 특히 토마토의 방어기작에 관여하여 병원화적 균주 Bv5-4a에 감염된 잎에서만 유도, 축적되었다. Isoelectric focusing(IEF)을 이용한 후 적어도 2개의 산성과 4개의 염기성 chitinase isoform이 감염된 토마토 잎 추출액에서 확인되었다. Native PAGE 젤에서 isoform Cb 1에 해당되는 pI 9.5를 지닌 chitinase isoform은 오직 불친화적 상호작용에서만 확인되었다. 이온이 제거된 Triton X-100을 처리하여 renaturation 시킨 후에 SDS-PAGE 젤 상태에서 23 kDa과 26 kDa을 지닌 2개의 chitinase isoform을 확인하였다.

• 대한약리학회지
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• 제32권3호
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• pp.433-444
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• 1996

본 연구에서는 열충격에 의한 세포내 단백질 변성을 정량하는 방법을 소개하고 있다. Thiol compound인 diamide [azodicarboxylic acid bis (dimethylamide)]는 단백질변성시 노출된 sulfyhydryl기를 cross-link 시킨다. 정상 상태에서는 노출되지 않는 sulfyhydryl group이 변성된 단백질에서는 노출되기 때문에 diamide에 의한 cross-linking이 선택적으로 일어날 것이다. 그러므로 diamide는 변성된 단백질을 "trap"하는 작용을 할 수 있다. 본 연구진은 세포내 열충격후 고분자 단백질 응집물 (high molecular weight protein aggregate, HAA)이 나타남을 비환원 (non reducing) SDS-PAGE에서 관찰하였고 이를 gas flow counter로 scanning하여 정량하였다. 실험 결과 세포에 열충격을 가한후 diamide를 처리하면 HMA가 열충격 용량의존적으로 증가함을 관찰하였다. 이는 HMA의 양을 측정함으로써 열충격에 의하여 변성된 단백질을 정량할 수 있음을 반증한다. 열내성이 유도된 세포와 그렇지 않은 세포를 비교하였을 때 열내성이 유도된 세포에서는 열충격에 의한 HMA의 형성이 억제됨을 관찰하였다. 열충격후 정상온도에서 회복기를 주면서 시간대별로 diamide를 첨가하고 이때 형성된 HMA양을 측정하여, 단백질 원형복구의 역동성을 실험하였다. 그 결과, HMA는 열내성의 유도 여부와 상관없이 빠르게 없어짐을 알 수 있었다. 그러나 열내성이 유도된 세포에서 HSP70 단항체를 electroporation에 의하여 투여하였을 때 HMA가 현저히 증가하였고, 이는 열내성이 유도된 세포에서는 HSP70의 증가에 의하여 HMA생성이 억제되었음을 나타낸다. HSP70 항체를 이용하여 면역침전을 시행한 결과 변성된 세포내 단백질이 HSP70과 같이 침전됨이 관찰되었다. 이 결과는 HSP70 단백질이 변성된 단백질과 일시적으로 결합하여 정상 상태로 돌아가거나 복구될 수 있도록 도와줄 수 있음을 시사한다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제30권11호
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• pp.1720-1728
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• 2020

We have previously characterized AprESJ4, the major fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis SJ4 (Yao et al., 2019). During that study, we observed a 68 kDa protein with fibrinolytic activity. In this study, we cloned the gene (vprSJ4) encoding the 68 kDa protein, a mature Vpr and minor protease secreted by Bacillus species. vprSJ4 encodes a preproenzyme consisting of 810 amino acids (aa) including signal sequence (28 aa) and prosequence (132 aa). The mature enzyme (650 aa) has a predicted molecular weight of 68,467.35. Unlike Vprs from other B. subtilis strains, VprSJ4 has 4 additional amino acids (DEFA) at the C-terminus. vprSJ4 was overexpressed in Escherichia coli. PreproVprSJ4 was localized in inclusion bodies, and subjected to in vitro renaturation and purification by an affinity column. SDS-PAGE and western blot showed that autoprocessing of preproVprSJ4 occurred and 68 kDa and smaller proteins were produced. The optimum pH and temperature of the recombinant VprSJ4 were pH 7.0 and 40℃, respectively. Kinetic parameters of recombinant VprSJ4 were measured by using an artificial substrate, N-succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilide. Coexpression of vprSJ4 and aprESJ4 using pHY300PLK increased the fibrinolytic activity a further 117% when compared with aprESJ4 single expression using the same vector in B. subtilis WB600.