• KSBB Journal
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• 제10권3호
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• pp.343-348
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• 1995

LeI은 스테로이드를 통울에 투여하였을 때 분비가 촉진되어 항염증성 효과를 나타내는 calcium 의 존성 phospholipid 결합 단백질이다. S. cerevisiae는 대장균과 통물세포의 장점을 모두 가지고 있으므로 동물세포 유래의 이종 단백질의 분비 생산에 많이 이용되고 있다. 본 연구에서는 GAL10 promoter­p ppL-LCI유전자 LCI terminator로 구성된 pYGLPT5 로 LCI을 S. cerevisiae SEY2102에서 발현 분비시키고 각 분획으로 나누어 LCI양을 비교한 결과 protoplast 68.6 %. periplasmic 24 %, culture supernatant 7.4%로 분포하였다. pYGLPT5로 형질전환된 S. cereviswe 2102를 유가 배양한 결과, 최종적인 LCI의 생산량은 약 $500mg/\ell$ 였다. LCI은 N 말단 부근에 $CA^{++}$ 결합부위가 있으므로 이를 이용하여 hydroxylapatite column chromatography로 정 제하 였다. 배지로 분비된 34kDa LCI을 ultrafiltration 과 hydroxylapatite column chromatography 의 두 단계로 순도 99% 이상으로 정제할 수 있었다.

• Journal of Microbiology
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• 제43권4호
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• pp.354-360
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• 2005

Heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is both a strong mucosal adjuvant and immunogen. It is a subunit vaccine candidate to be used against ETEC-induced diarrhea. It has already been expressed in several bacterial and plant systems. In order to construct yeast expressing vector for the LTB protein, the eltB gene encoding LTB was amplified from a human origin enterotoxigenic E. coli DNA by PCR. The expression plasmid pLTB83 was constructed by inserting the eltB gene into the pYES2 shuttle vector immediately downstream of the GAL1 promoter. The recombinant vector was transformed into S. cerevisiae and was then induced by galactose. The LTB protein was detected in the total soluble protein of the yeast by SDS-PAGE analysis. Quantitative ELISA showed that the maximum amount of LTB protein expressed in the yeast was approximately $1.9\%$ of the total soluble protein. Immunoblotting analysis showed the yeast-derived LTB protein was antigenically indistinguishable from bacterial LTB protein. Since the whole-recombinant yeast has been introduced as a new vaccine formulation the expression of LTB in S. cerevisiae can offer an inexpensive yet effective strategy to protect against ETEC, especially in developing countries where it is needed most.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권1호
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• pp.68-75
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• 1998

A. niger의 GOD(Glucose Oxidase) 대량생산과 효율적인 분비를 protein의 대량생산에 많이 사용되는 strain인 S. cerevisiae에서 시도하였다. S. cerevisiae의 ADH1과 GAL 10 promotor, 그리고 ${alpha}$-MF signal sequence와 A. oryzae의 ${alpha}$-amylase signal sequence 및 S. cerevisiae의 GAL7과 A. niger의 GOD terminator를 이용하여 4개의 expression vector를 합성한 후 S. cerevisiae 2805에 auxotroph 방법으로 형질변환시켰다. 변이체들을 배양하여 세포내와 세포외의 GOD활성도를 분석한 결과 GAL 10 promotor가 삽입된 pGAL변이체들이 ADH1 promotor가 삽입된 pADH 변이체들 보다 GOD 생산성이 높았다. GAL 10 promotor와 A. oryzae의 ${alpha}$-amylase signal sequence가 삽입된 pGALGO2에서 115시간 배양시 GOD의 생산이 가장 높았다($GOD_{total}$: 10.3 unit/mL, $GOD_{ex}$: 8.7 unit/mL). 이 수치는 같은 promotor인 GAL 10 promotor와 ${alpha}$-MF signal sequence가 삽입된 pGALGO1보다 3배정도 높다. 이 결과는 ADH 1 promotor를 사용하였을 경우에도 일치하였다. 또한 A. oryzae의 ${alpha}$-amylase signal sequence가 S. cerevisiae의 ${alpha}$-MF signal sequence보다 GOD를 더 효과적으로 분비시켰다. 상기 결과로 미루어 보면 signal sequence가 단백질의 분비 외에도 단백질 합성에도 많은 영향을 주는 것으로 추측된다. pGALGO1과 pGALGO2의 GOD분비효율은 각각 89%, 84%이었다. S. cerevisiae에서는 일반적으로 과당화가 일어나기 때문에 S. cerevisiae에서 합성된 재조합 GOD의 분자량은 250 kDa으로 A. niger의 GOD(170 kDa)보다 더 컸다.

• Journal of Microbiology
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• 제37권2호
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• pp.51-58
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• 1999

Using yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the integrate vector system, we have isolated and characterized an autonomously replicating sequence (ARS) from Aspergillus nidulans. The DNA fragment, designated ANR1, is 5.0 kb in size and maintained free from the chromosome in S. cerevisiae. The YIplac211-ANR1 recombinant plasmid, which consists of sequences derived from the yeast integrative vector YIplac211 and 5.0 kb ANR1 fragment, showed a 104-fold enhancement in transformation efficiency over that found for YIplac211, and was easily recovered from the transformed yeast. Genetic analysis of transformants showed that YIplac21-ANR1 could be over 96% cured when cultured over 20 generations in complete medium and thus suggests that this sequence is mitotically unstable. In A. nidulans, recombinant plasmid PILJ16-4.5 which carries the 4.5 kb EcoRI fragment of ANR1 showed a 170-fold enhancement in transformation efficiency compared to that of the integrative vector PILJ16.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권5호
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• pp.502-510
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• 2009

Although the Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) has already been expressed in several different systems, including prokaryotic and eukaryotic organisms, studies regarding the synthesis of LTB into oligomeric structures of pentameric size in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae have been limited. Therefore, this study used a functional signal peptide of the amylase 1A protein from rice to direct the yeast-expressed LTB towards the endoplasmci reticulum to oligomerize with the expected pentameric size. The expression and assembly of the recombinant LTB were confirmed in both the cell-free extract and culture media of the recombinant strain using a Western blot analysis. The binding of the LTB pentamers to intestinal epithelial cell membrane glycolipid receptors was further verified using a GM1-ganglioside enzyme-linked inmmunosorbent assay (GM1-ELISA). On the basis of the GM1-ELISA results, pentameric LTB proteins comprised approximately 0.5-2.0% of the total soluble proteins, and the maximum quantity of secreted LTB was estimated to be 3 mg/l after a 3-day cultivation period. Consequently, the synthesis of LTB monomers and their assembly into biologically active aligomers in a recombinant S. cerevisiae strain demonstrated the feasibility of using a GRAS microorganism-based adjuvant, as well as the development of carriers against mucosal disease.

• KSBB Journal
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• 제19권6호
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• pp.441-445
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• 2004

본 연구에서는 사람 ferritin H- 및 L-chain 유전자가 재조합된 효모 S. cerevisiae에 있어서 철의 생체 흡수 반응을 수행하였다. 재조합 효모는 $2\%$ galactose가 첨가된 YEP 배지에서 3일간 batch culture한 후, 20 mM MOPS buffer (pH 6.5) 에서 반응 균체 농도, 철 화합물 종류, 철 농도, 및 반응 시간 등을 고려하여 반응을 진행하였다. 이 실험 결과, ferritin H-chain 유전자를 발현하는 균주 YGH2에 있어서 균체 농도 100 mg/ml에서 균체 농도 200 mg/ml보다 높은 철 농도를 보였다. 그리고, 철 흡수 반응에 있어서 Fe(II)의 산화 상태가Fe(III)보다 훨씬 유리하였다. 철 농도의 증가에 따라 철 흡수량도 증가하였으며, 14.3 mM Fe(II)과 반응시 YGH2의 세포내 철 농도는 $16.7{\pm}0.7\;{\mu}mol/g$ cell wet wt.로 분석되었다. 철 흡수는 반응 시작 후 약 120분 경에 거의 최대치에 이르렀다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권5호
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• pp.406-412
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• 1998

Trichoderma sp. C-4 유래의 endoglucanase 유전자(egl6)를 ADH1 promoter 하류에 연결하여 구성적 발현 plasmid인 pVT-C4를 제작하였다. 이를 3종의 S. cerevisiae숙주세포(YNN27, 2805, SEY2102)에 형질전환시켜 각 숙주세포당 80개의 형질전환체를 시험배양하여, 균체증식과 endoglucanase 발현량이 뛰어난 형질전환 효모 균주를 선별하였다. 3종의 재조합 효모를 YPD 배지에서 회분 배양했을 때, YNN27 균주가 가장 낮은 균체농도(OD$_{600}$=19)를, 2805 균주가 가장 높은 균체농도(OD$_{600}$=33)를 보였으며, 총 발현된 endoglucanase 활성은 균체농도에 의존적인 양상으로 나타나 YNN27의 경우 586 unit/l, SEY2102의 경우 1023 unit/l, 2805의 경우 1142 unit/l 순서로 증가하였다 비활성(균체농도당 endoglucanase활성 )은 세 균주 모두 31~34 unit/l/OD$_{600}$ 값을 보여 단위 균체당 발현능 차이는 거의 없었다. Plasmid 안정성은 배양 72시간에서 세 균주 모두 80% 이상의 높은 값을 보였다. 발현된 endoglucanase의 분비 국재성은 세포밖 배지에 약 80%, periplasmic space 잔존 활성이 11~13%, 세포질 분획에서의 활성이 8~10% 정도로 세 균주에서 모두 비슷한 분포를 보였다. 즉, egl6의 분비신호는 S. cerevisiae에서도 매우 효율적으로 분비 기능을 발휘하였다. 재조합 endoglucanase는 nondenaturing-PAGE 상에서 전형적인 당단백질의 disperse band를 두개 보였다. 세가지 숙주세포에 따른 재조합 endoglucanase활성 band들의 이동상의 차이는 거의 나타나지 않고, 당쇄부가 양상은 야생형보다 훨씬 더 복잡하고 불균일하게 발생했음을 알 수 있었다.수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권7호
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• pp.999-1006
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• 2015

The endo-polygalacturonase gene (endo-pgaA) was cloned from DNA of Aspergillus niger SC323 using the cDNA synthesized by overlapping PCR, and successfully expressed in Saccharomyces cerevisiae EBY100 through fusing the α-factor signal peptide of yeast. The fulllength cDNA consists of 1,113 bp and encodes a protein of 370 amino acids with a calculated molecular mass of 38.8 kDa. After induction by galactose for 48 h, the activity of recombinant endo-PgaA in the culture supernatant can reach up to 1,448.48 U/mg. The recombinant protein was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation and gel filtration column chromatography and subsequently characterized. The optimal pH and temperature of the purified recombinant enzyme were 5.0 and 50℃, respectively. The Michaelis-Menten constant (K_m) and maximal velocity (V_max) of the enzyme for pectin were 88.54 μmol/ml and 175.44 μmol/mg/min, respectively. The enzyme activity was enhanced by Ca²⁺, Cu²⁺, and Na⁺, and strongly inhibited by Pb²⁺ and Mn²⁺. The pectin hydrolysates were mainly galacturonic acid and other oligo-galacturonates. Therefore, these characteristics suggest that the recombinant endo-PgaA may be of potential use in the food and feed industries.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제6권4호
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• pp.306-308
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• 2001

A recombinant human growth hormone(hGH) was expressed as a secretory product in the yeast Saccharomyuces cerevisiae. There different leader sequences derived from the mating fac-tor $\alpha$1(MF$\alpha$1) inulinase and invertase were used to direct the secretion of hGH into the extracel-lular medium. Among three leader sequences tested, the inulinase leader sequence was found to be the most efficient in the secretory expression of hGH. In contrast, no hGH was detected in the ex-tracellular medium with the invertase leader sequence. After 48 h shake-flask culture, the yields of hGH secreted into th emedium by the invertase. MF$\alpha$1 inulinase and invertase leader sequences were approximately 0, 0.3 and 0.9 mg/L, respectively. The secretion efficiencies were also found to be 0, 3.8 and 13% for the invertase , MG$\alpha$1 and inulinase leader sequences, respectively.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제4권
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• pp.36-41
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• 1986

대장균(大腸菌)과 효모(酵母)의 셔틀 벡터인 YIp, YRp, YEp를 S. cerevisiae MC 16, DBY747에 형질전환(形質轉換)시켰다. 이들 벡터들을 대장균(大腸菌)에 형질전환(形質轉換)시켰을 때 그 빈도(頻度)가 YIp5, YIp26, YEp13, YRp7에서 각각 $5.1{\times}10^{-4}$, $1.5{\times}10^{-3}$, $3{\times}10^{-3}$, $1.3{\times}10^{-3}$으로 나타났다. YEp13을 MC16과 DBY747에 Ito 법(法)으로 형질전환(形質轉換)시켰을 때 MC16, DBY747에서의 빈도(頻度) 각각 $3.3{\times}10^{-4}$, $1.2{\times}10^{-4}$으로 나타났다. DBY747을 수용세포(受容細胞)로 하여 YRp7과 YIp26을 환상(環狀)으로 각각 형질전환(形質轉換)시켰을 때 그 빈도(頻度)는 각각 $3{\times}10^{-6}$, $6{\times}10^{-8}$이하로 나타났다. DBY747을 수용세포(受容細胞)로 하여 YEp13과 YIp26을 선상(線狀)으로 절단하여 $Li^+$ 처리(處理)한 S. cerevisiae에 cotransformation을 하였을 때 YIp26+YEp13 ($Leu^+$, $Ura^+$)의 cotransformant는 $1{\times}10^{-5}$ 빈도(頻度)가 나왔으며 YIp26과 YEp13에 대한 각각의 빈도(頻度)는 $10^{-7}$ 이하, $5{\times}10^{-5}$ 빈도(頻度)로 나타났다. 또 YIp5와 YEp13, YIp26과 YRp7을 원형질체화(原形質體化)한 S. cerevisiae DBY747에 cotransformation 하였을 때 빈도(頻度)는 YIp5+YEp13은 $4{\times}10^{-6}$으로 나오고 YIp26+YRp7에서 $1.5{\times}10^{-6}$으로 나타났다.