• 미생물학회지
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• 제31권4호
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• pp.279-285
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• 1993

p53 유전자의 변화는 인간의 여러 암에서 가장 흔하게 발견되며 종양세포내에서는 이러한 변형된 p53 단백질의 양의 증가가 초래된다. 세포내에 축적된 p53 단백질의 발견은 인간의 암증세를 판단할 유용한 기중이 되기도 한다. 본 연구에서는 이러한 면역조직화학 검사에 쓰일 수 있는 폴리클로날 항체를 만들기 위햐여 사람의 p53 유전자를 glutathione S-transferase 와의 융합 단백질의 형태로서 대장균내에서 발현시켰다. p53 의 아미노산 1-158번을 코딩하고 있는 NeoI fragment 와 아미노산 159-393 번을 코딩하는 NocI-BamHI fragment 를 BamHI linker 를 이용하여 in frame 으로 pGEX-2T 의 BamHI 자리에 삽입하여 재조합 플라스미드 pGTNS 와 pGTNL 을 각각 만들었다. 또 PCR 에 의한 증폭에 의햐여 아미노산 38-145번을 코딩하는 유전자 부위를 증폭하였으며 BamHI 과 PvuII 로 절단하여 pGEX-2T의 BamHI 과 SmaI 자리에 삽입함으로써 pGTBP 를 제조하였다. 이들 재조합 균주들을 IPTG 로 4시간 induction 한 후 세포 추출물로부터 glutathione Sepharose bead 를 이용하여 융합단백질을 분리하였다. Bead 에 결합된 단백질은 10% SDS-polyacrylamide gel 에서 전기영동하였으며, 각각의 분자량은 54 kDa, 53 kDa 와 40 kDa 였다. 이러한 방법으로 1리터 배양으로부터 약 1mg 의 단백질을 정제하였다.

• 한국균학회지
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• 제24권1호통권76호
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• pp.8-16
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• 1996

토양에서 분리된 A. alternata의 조효소액은 ammonium sulfate 염석, 투석 Sephadex G-100 column chromatography를 통하여 정제한 후 SDS-polyacrylamide gel 전기영동에 의해 단일 band의 ${\alpha}-amylase$를 얻었다. 이 효소의 물리화학적 특성을 분석한 결과는 다음과 같다. 1. 정제 효소의 최적 활성 pH는 5.0이었고 pH안정성 범위는 pH$3.6{\sim}7.0$으로 비교적 산성에서 안정성을 보이는 내산성 효소로 나타났다. 2. 효소의 최적 활성 온도는 $40^{\circ}C$, 열에 대한 안정성 범위는 $20{\sim}60^{\circ}C$로 나타났으며 $80^{\circ}C$에서 30분 열처리시 잔존 활성이 71%로 세균류와 거의 동일한 내열성을 보였다. 3. 본 효소는 $Mn^{2+},\;Zn^{2+}$ 및 $Sn^{2+}$의해 활성이 촉진되었으나 $Ba^{2+},\;Pb^{2+},\;Co^{2+},\;Ag^{1+}$에 의해 저해효과를 나타냈으며 또한 $Hg^{2+},\;Mn^{2+}$는 $10^{-3}M$ 및 $10^{-4}M$ 농도에서 저해작용을 나타냈다. 그러나 최대 활성 저해시 잔존 활성이 83%로 본 효소는 전반적으로 금속 이온의 영향을 크게 받지 않았다. 4. 본 효소의 soluble starch에 대한 $K_m$ 값은 $6.50{\times}10^{-2}$ M이었으며 1mM EDTA에 대한 $K_i$ 값은 $8{\times}10^{-2}M$로서 경쟁적 저해작용을 하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제20권5호
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• pp.574-582
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• 1992

Bacillus stearothermophilus exo-xylanase 유전자 DNA가 삽입된 재조합 plasmid pMG1을 가지고 있는 E.coli JM109 exo-xylanase 생산 최적 배양 조건, 생산 효소의 정제 및 정제 효소의 특성 등을 조사 연구하였다. 상기 재조합 E.coli 균주는 0.5 fructose, 0.5 yeast extract, 1.0 tryptone 및 1.0 sodium chloride가 함유된 배지에서 약 10시간 배양했을 때 최대량의 효소를 생산하였으며 생산효소의 94는 세포내에 존재하는 것으로 분석되었다. 생산 효소는 ammonium sulfate 분획, ion exchange chromatography 및 gel filtration 등의 과정을 거쳐 단일 단백질로 정제하였으며 정제 효소는 pH 6.0과 $45^{\circ}C$에서 가장 높은 효소 활성을 나타내었다.또한 1mM $Ca^{2+}$과 $Co^{2+}$ 이온의 첨가는 각각 약 25% 정도의 활성화 효과를 나타내는 반면, 본 효소의 pNPX에 대한 $K_{m}$은 2.75mM, pl값을 4.7, 그리고 분자량은 gel-filtration 법으로는 약 200,000dal., SDS-polyacrylamide gel 전기영동법으로는 약 66,000dal 으로 측정되어 세 개의 동일한 subunit로 구성된 효소 단백질인 것으로 추정되었다. 본 정제 효소는 xylobiose, xylotrioxe 및 xylotetraose 등의 xylo-oligosaccharide를 효과적으로 분해함은 물론이고, 분해율은 낮으나 birchwood xylan, larchwood xylan 및 oatspelt xylan 등의 xyland에도 작용, xylose 생산을 확인함으로써 본 효소는 그 예가 극히 드문 bacterial exo-xylanase인 것으로 분류되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제20권5호
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• pp.551-558
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• 1992

Streptomyces sp. S56으로부터 endoinulase를 생산하고 정제하여 물화학적으로 성질을 조사하였다. 조효소는 DEAE-cellulose column chromatography 및 Sephadex G-200 gel filtration에 의하여 정제하였으며, 정제된 효소는 polyacrylamide gel 전기영동결과 단일 band로 나타나서 전기영동상 순수하게 분리되었다. 정제효소의 최적 pH는 5.5-6.0, 최적온도는 $50^{\circ}C$였으며, 최적 온도에서의 열안정성은 1시간 처리후 42%의 잔류활성을 보였다. 정제효소는 금속이온 중 $Mn^{2+}$에 의해서는 활성이 증가되었으나, $Ag^{+}$, $Hg^{+}$, $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Fe^{3+}$, $Mo^{6+}$ 에 의해서는 활성이 50% 이상 감소하였다. EH한 EDTA, 8-hydroxyquinoline에 의하여 활성이 저해되는 것으로 보아 metalloenzyme인 것으로 추정되었다. 본 효소는 inulin 내부의 $\beta$-2,1 결합을 가수분해하여 fructose oligomer를 생산하는 inulase 활성만을 가지고 있었으며 invertase 및 $\alpha$-glucosidase 활성은 나타내지 않았다. Inulin에 대한 Km값은 0.287mM, $V_{max}$ $0.109{\mu}mol/min$이었다. 효소의 촉매작용에 관하여는 amino acid residue는 tryptophan로 추정되었으며 그 외에 arginine, tyrosine, lysine, methionine, histidine, cysteine 및 cystine의 chemical modification 실험결과 효소활성저해가 나타나지 않아 이들 amino acid residue는 효소작용에 직접적으로 관여하지 않는 것으로 추정되며 carboxyl기도 효소활성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

• 한국축산식품학회지
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• 제24권4호
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• pp.326-328
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• 2004

본 연구는 국산 배에서 단백질 분해효소를 분리, 정제하여 단백질 효소의 농도별 돈육 등심에 대한 연화 정도를 측정하여 가장 적당한 농도를 찾고자 실시하였다. 단백질 함량은 5.96 $\mu\textrm{g}$/mL와 7.25$\mu\textrm{g}$/mL을 나타냈었으나 투석한 경우는 신고가 0.19$\mu\textrm{g}$/mL, 추황이 0.24$\mu\textrm{g}$/mL를 나타내 투석할 경우 오히려 단백질 함량이 감소하였다. 투석한 단백질 분해효소를 첨가하지 않은 대조구와 각각 0.05%, 0.1% 및 0.2%를 첨가한 후 81$^{\circ}C$에서 가열한 후 냉각한 돈육 등심의 전단력은 신고에서 6.24, 5.69, 5.37 및 5.58을 추황에서 5.44, 4.92, 4.65 및 4.80을 나타냈다. 신고와 추황의 정제된 단백질 분해효소를 0.1% 첨가했을 때 가장 낮은 전단력을 보였고 첨가하지 않은 것에 비해 각각 14%와 15%의 감소를 나타냈다. 전기영동에 의한 단백질의 분자량은 약 30kDa을 나타냈다. 연도에 최대 효과를 줄 수 있는 적정함량은 0.1% 이상이라 사료된다.

• 한국식품과학회지
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• 제9권3호
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• pp.183-189
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• 1977

고정화(固定化) 균체(菌體)를 이용(利用)한 pyridoxal 5'-phosphate(pyridoxal-p)의 연속생산(連續生産)에 관(關)해실험(實驗)하였다. pyridoxine 5'-phosphate (pyridoxine-p) oxidase활성(活性)을 갖는 Pseudomonas polycolor 균체(菌體)와 Catalase 활성(活性)을 갖는 Kloeckera sp. No. 2201균체(菌體)를 효소원(酵素源)으로 사용(使用)하였다. 균체(菌體)는 Polyacrylamide gel에 불용화(不溶化) 시켰으며 동시고정균체(同時固定菌體)의 활성(活性)이 Pseudomonas Polycoler단독고정균체(單獨固定菌體)의 활성(活性)보다 강(强)하였다. 이 결과(結果)는 동시고정균체(同時固定菌體)의 Pyridoxine-p oxidase-cat-alase system은 Pyridoxine-p 산화(酸化)의 부산물(副産物)인 $H_2O_2$를 분해(分解)하므로서 보호효과를 얻을 수 있음을 의미(意味)한다. 동시고정균체(同時固定菌體)와 생균체(生菌體)의 효소활성(酵素活性)에 미치는 최적(最適)pH는 9.0이었고 동시고정균체(同時固定菌體)의 최적온도(最適溫度)는 $45^{\circ}C$로 생균체(生菌體)보다 $5^{\circ}C$높았다. 고정균체(固定菌體)의 Pyridoxine-p oxidase는 $Hg^{2+}$와 몇몇 SH-화합물(化合物)에 의(依)하여 활성화(活性化)되었다.

• 생명과학회지
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• 제30권11호
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• pp.1012-1020
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• 2020

생쥐의 가변부위가 인간의 정상부위에 연결되어 제조된 바이오시밀러 자연항체치료제인 레미케이드는 암괴사인자-알파(TNF-α)에 특이적인 항체로써 카이메릭 단일클론항체이며 류마티스 관절염치료를 위해 개발되었다. 바이오시밀러 레미케이드 항체의 생물학적 기능을 연구하기 위해 우리는 단백질 데이터 은행을 이용한 생물정보학 분석을 수행하여 레미케이드 자연항체와 암괴사인자-알파 항원간의 결합기작특징을 분석하였다. 자연항체를 생산하는 세포의 유전적 불안정성 때문에 레미케이드 항체생산이 제한되므로 우리는 중 사슬 가변부위를 다중펩타이드 링커에 의해 경 사슬 가변부위에 연결된 레미케이드 ScFv항체(Remicade)를 제조하였다. 더욱이 더 높은 생산과 더 높은 항원결합력을 위해 레미케이드 ScFv를 leucine zipper에 융합시켰다. Remicade와 RemicadeScZip ScFv는 대장균에서 발현되었고 Ni⁺-NTA-아가로스 컬럼으로 정제하였다. 정제된 단백질들은 예상한대로 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis에서 28.80 kDa과 33.96 kDa을 나타내었다. Remicade는 ELISA, western blot에서 TNF-α 항원에 대한 결합력이 관찰되지 않았으나 RemicadeScZip은 항원결합력을 나타내었다. 추가적인 BLI분석으로 RemicadeScZip의 TNF-α 항원에 대한 결합력을 재확인시켜주었으며 이 결과는 Leucine zipper가 레미케이드 ScFv의 접힘을 안정화시키고 TNF-α 항원에 대한 결합력을 개선시켰음을 제시해주고 있다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권4호
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• pp.316-322
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• 1998

N-$\varepsilon$-aminocaproyl-$\alpha$-D-galactopyranosylamine-sepharose를 담체로 하는 affinity chromatography에 의한 해바라기씨 유래 $\alpha$-galactosidase($\alpha$-D-galactoside galactohydrolase EC 3. 2. 1. 22)의 정제방법과 정제효소에 대한 효소화학적 성질을 규명하였다. N-$\varepsilon$-aminocaproyl-$\alpha$-D-galactopyranosylamine의 흡착제를 합성하여 sepharose에 coupling하였다. 기질 p-nitrophenyl $\alpha$-D-galactopyranoside에 대한 정제효소의 비활성은 291.66 units/mg였고, 조효소와 비교하여 115배의 정제 배율을 나타내었다. 정제효소의 순도는 SDS-polyacryl amide gel전기 영동법 에 의해 단일 band를 나타내었으며, 분자량은 42,000으로 추정되었다. 정제효소의 최적 pH와 온도는 4.5, 55$^{\circ}C$이며, pH 4-5, 30-55$^{\circ}C$의 범위에서 pH와 온도 안정성을 나타내었다. 또한 정제효소는 Ag$^{2+}$, Hg$^{2+}$, CO$^{2+}$의 금속에 의해 70%이상의 저해효과를 나타내었다. 정제효소는 melibiose, raffinose 및 copra galactomannan에 대한 galactose의 유리를 TLC에 의해 확인하였고, 각 기질에 대한 galactose의 가수분해 속도를 HPLC에 의해 비교하였다.

• 한국산림과학회지
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• 제102권2호
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• pp.223-228
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• 2013

파이토플라스마 증폭 프라이머, P1/P7 및 R16F2n/R2를 이용하여 뽕나무 품종 42개체에 대하여 뽕나무오갈병 파이토플라스마의 전염여부를 조사한 결과 공시 모두에서 파이토플라스마가 검출되었다. 뽕나무오갈병 파이토플라스마 단일염기변이를 SSCP분석기법을 응용하여 분석조건을 조사한 결과 P1/P7(약 1.8 kb) 및 R16F2n/R2(약 1.2kb)로 증폭한 PCR산물에서는 6% polyacrylamide gel 농도, 150V, $10^{\circ}C$의 전기영동 조건에서 SSCP밴드패턴이 나타났다. 유사한 SSCP밴드 패턴을 보이는 두 시료간의 밴드형태를 뚜렷하게 구별하는 방법을 찾기 위하여 뽕나무 오갈병파이토플라스마와 대추나무 빗자루병 파이토플라스마의 P1/P7 및 R16F2n/R2 프라이머로 증폭한 PCR산물을 혼합한 후 SSCP분석 결과, 전기영동상에서 대추나무 파이토플라스마와 뽕나무 파이토플라스마의 SSCP 밴드패턴 모두를 관찰할 수 있었다. 본 연구 결과, 기존에 약 600 bp 크기로 한정된 것으로 알려진 SSCP 분석법을 응용하여 파이토플라스마 PCR 산물 1.8 kb 또는 1.2 kb 크기에서도 유사한 SSCP 밴드패턴에 의하여 단일염기변이를 검출할 수 있었다.

• 한국양식학회지
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• 제2권1호
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• pp.9-20
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• 1989

본 실험은 rivanol 침전법, iron-staining method, SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis 그리고 $^{59}FeCl_3$ sutoradiography를 이용하여 tilapia(Oreochromis niloticus) 혈청으로부터 transferrin을 분리 추출하며, Hardy-Weinberg법칙을 이용하며 유전자 빈도와 유전자형 빈도 추정하기 위하여 시도하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 1. Tilapia의 transferrin은 albumin보다 상대적으로 느린 전기영동도와 높은 분자양의 크기를 가졌고, globulin 보다는 빠른 전기영동도와 낮은 분자양을 나타내었다. 2. 염색방법을 달리하여 transferrin의 band를 비교하였을 때, 별다른 차리를 발견하지 못했다. 3. Rivanol 대 혈청의 비율은 2 : 1이 가장 적합했고, 모든 분획에 이 비율을 이용하였다. 4. Transferrin의 분자양은 각 70,000$\pm$2,000을 나타내었다. 5. Transferrin의 종내 다형현상을 나타내었다. 6. 3개의 transferrin 변이체(A,B 그리고 C)가 발견되었고, Tf형은 3개의 공동 우성 대립유전자(Tf A, Tf B 그리고 Tf C)에 의해 조절되며, 6개의 가능한 표현형(Tf AA, Tf AB, Tf AC, Tf BC 그리고 Tf CC)중에서 5개의 표현형만이 발견되었고, Tf CC형은 발견되지 않았다. 7. 3개의 대립유전자 Tf A, Tf B 그리고 Tf C의 빈도는 각각 0.795, 0.15 그리고 0.055 이었다.