리그닌 분해효소의 생산은 나선형 리본이 있는 새로운 형태의 회전식 통풍관 생물 반응기(RTB)를 사용하여 느타리(Pleurotus ostreatus) No.42에 의해 실시하였다. 락게이즈(laccase)의 최대 생산량은 배양 3일 후 약 8,200 U/bioreactor 수준에 도달한 후 감소하였다. 반면에, 망간퍼옥시데이즈(MnP)의 최대 생산은 6일 배양 후 약 8,400 U/bioreactor의 수준에 도달하였다. 그러나 이 발효조에서 리그닌퍼옥시데이즈(LiP)는 검출되지 않았다. 그 결과 회전식 통풍관 생물 반응기(RTB)가 리그닌 분해효소를 대규모 생산을 위해 성공적으로 생산할 수 있음을 보여주었다. 이 발효기에서 망간퍼옥시데이즈의 정제 과정은 Sepharose CL-6B, Superdex 75 prep grade 및 Mono-Q에 대한 크로마토그래피를 포함하여 정제하였다. 이 주요 효소는 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide겔 전기영동(SDS-PAGE)에서 분자량 36,400, pI 3.95의 등전점(IEF)으로 각각 확인되었다. 이 발효기의 주요 효소 N-말단 서열은 정치 및 진탕배양과 같은 다른 배양조건에서 보고된 MnP3 효소와 동일하였다.
느타리버섯의 건조방법별 30% 발효주정의 추출 기간을 달리하여 폴리페놀 함량을 분석하였다. 폴리페놀의 함량은 건조방법별로는 동결건조법으로 처리한 시료가 가장 높았고, 추출 기간별로는 15일의 시료가 높게 측정되었다. 동결건조법으로 15일 추출한 각 균주별 폴리페놀 함량은 '수한'은 $0.41{\pm}0.01mg/mL$, '춘추2호'는 $0.44{\pm}0.02mg/mL$, '고솔'은 $0.48{\pm}0.02mg/mL$으로 각각 나타났다. 항산화능과 항염의 효능은 동결건조법으로 처리하여 30일 동안 추출한 시료가 높게 나타났으며, 각 균주별 자유라디칼, 아질산염의 제거 비율을 살펴보면, '수한'은 $30.97{\pm}1.88%$, $45.66 {\pm}1.98%$, '춘추2호'는 $35.50{\pm}3.29%$, $34.47{\pm}9.89%$, 고솔은 $35.47{\pm}4.90%$, $48.40{\pm}3.38%$으로 각각 나타났다. 건조방법별로는 열풍 건조법 보다는 동결 건조법이 시료의 폴리페놀 함량, 항산화능 및 항염의 효능을 잘 나타나게 하는 건조법이었고, 추출기간별로 살펴보았을 때, 폴리페놀의 함량은 15일, 항산화능, 항염의 효과는 30일 추출한 시료가 가장 높았다. 이 결과는 15일까지는 페놀성 물질들이 충분히 빠져나온다는 것을 알 수 있고, 15일 이후에는 페놀성 화합물 외에 항산화 항염에 관여하는 물질들이 추출되어 항산화능, 항염의 효능을 높인다는 것을 추측할 수 있었다. 본 연구에서는 건조방법으로는 동결건조법, 추출기간은 15일 이상으로 하여 추출했을 때 폴리페놀의 함량이 가장 높고, 항산화능, 항염 효능이 높은 것으로 나타났다. 느타리버섯류는 건조 방법별 추출 기간별로 폴리페놀의 함량에 따른 항산화능과 항염의 효능이 다르게 나타나기 때문에 적절한 건조법과 추출 기간의 선택이 필요하다는 것을 알 수 있다. 이는 기능성 식품 및 건강식품을 개발하는데 있어 중요한 자료로 활용 할 수 있을 것이라고 생각된다.
본 연구에서는 병 재배 버섯 안정생산을 위한 우량종균확보 방법으로서 액체종균을 활용하고자 하였으며 액체종균을 버섯재배에 효율적으로 사용할 수 있는 접종방식 및 접종장치를 개발하였다. 느타리 및 팽나무버섯의 대량 액체배양의 조건은 팽나무버섯은 접종량 $5{\sim}6%$, 배양기간 4일 일 때, 그리고 느타리버섯은 접종량 $5{\sim}6%$, 배양기간 5일에서 최대 균사생장을 확인 할 수가 있었다. 자동접종시스템을 이용하여 균사생장 및 자실체 생산에 대한 조사를 실시한 결과, 느타리버섯의 경우 자실체 생산에서는 접종량 6%, 즉 15ml 에서 수량이 높게 나타났다. 팽나무버섯은 접종량 $4{\sim}6%$, 즉 $10{\sim}15ml$에서 자실체 수량이 다른 조건에 비해 우수하게 나타났다. 액체종균 자동접종시스템을 이용하는 것이 고체종균 접종시스템보다 느타리버섯은 33.7%, 팽나무버섯은 32.8% 증수효과를 확인할 수 가 있었다. 작업성능의 평가를 위해 $4{\times}4$배열의 병 재배용 tray 75개를 이용하여 병의 뚜껑을 제대로 열고 닫지 못하는 경우, 분사가 안되는 경우 등의 오동작은 없었고 작업시간은 26분으로 단축되었다.
본 연구는 아미노산과 질소원이 증진된 수확후배지를 재사용하고, 느타리에서 영양원으로 사용되는 면실박의 사용을 줄이기 위해 수행되었다. 수확후배지의 질소원 증진을 위해 두 가지의 세균이 사용 되었으며, GM20-4는 느타리버섯의 수확후배지부터 분리되었고, Rhodobacter sphaeroides는 광주시농업기술 센터로부터 분양받았다. 처리구에 사용된 수확후배지는 건조 후 사용했으며, 위의 2가지의 미생물 처리에 의해 수확후배지의 총질소 함량은 0.34% 증가되었다. 8% D-SMS 가진 T1처리구와 18% D-SMS가 첨가된 T2가 대조와 T3처리구보다 발이율이 높았으며, 생물학적 효율은 대조 110%, T1이 114%, T2가 112%, T3가 79%로 조사되었다. 경제성, 수량 및 생물학적 효율을 고려해볼 때 18% 건조 수확후배지를 사용한 T2가 느타리 재배배지로 가장 효율적인 것으로 조사되었다.
총탄소함량은 T4를 제외한 모든 처리구에서 대등하였으며, 총질소함량은 T3에서 2.17%로 대조구에 가장 근접한 값을 나타내었다. C/N율은 T4에서 39로 다른 처리구보다 높았다. 혼합배지에 따른 자실체의 생육특성을 조사한 결과 갓직경은 T2에서 가장 컸고, 대직경은 T2와 T4에서 가장 컸고, 대길이는 T1과 T2에서 가장 많았다. 유효경수는 T1과 T3에서 가장 많았다. 혼합배지에 따른 처리구별 수량은 T3에서 171g/병으로 대조구와 대등하였고, 회수율도 89.2%로 대조구와 대등한 결과를 나타내었다.
SSR은 병렬적으로 반복되는 작은 DNA서열을 말하며, 다양한 마커 기반 연구에 활용되고 있다. 국내의 주요 느타리품종인 '흑타리'와 '미소'의 유전체를 Pacbio를 이용하여 해독하였고 이 서열 정보에서 생물정보학을 이용하여 SSR을 분리하여 특성구명을 하였다. '흑타리'와 '미소' 유래 단핵균사의 유전체의 크기는 각각 40.8 Mbp와 40.3 Mbp로 밝혀졌고, 이는 사철느타리의 단핵균사 PC9과 PC15보다 컸으나, 큰느타리보다는 작았다. 총 949개와 968개의 SSR이 '흑타리'와 '미소'의 유전체 분석을 통하여 각각 검출되었다. 5개의 느타리류 유전체의 SSR 분포와 특징을 비교분석한 결과 흑타리와 미소의 SSR 갯수가 가장 많았으며, 이들의 반복서열의 분포는 다른 느타리류와 비슷한 경향을 보였다. 3-mers, 6-mers와 8-mers가 가장 발견빈도가 높은 패턴이었다.
본 연구의 목적은 느타리버섯과 큰느타리버섯의 균사체 계대배양에 따른 유전적 변이 양상을 조사하고, 각각의 이핵체와 단핵체를 RAPD 방법으로 계대배양 횟수에 따른 변이를 조사하는 것이다. 또한, 유전적 변이와 생장력과의 관계를 추적하기 위하여 계대배양 횟수 및 종에 따른 생장력을 조사하였다. 그 결과, 균사생장력은 대체적으로 3회와 4회째 계대배양 때의 생장속도가 가장 빨랐으며, 5회째 이상부터는 감소하였다. 느타리버섯 이핵체는 가장 빠른 생장속도를 보였으며, 느타리버섯 단핵체와 큰느타리버섯 이핵체, 단핵체는 거의 비슷한 속도로 생장하였다. 또한, 느타리버섯의 이핵체와 큰느타리버섯 이핵체 간의 생장속도는 동일한 조건에서 약4배의 차이기 났다. 유사성 조사에서는 느타리버섯 이핵체는 57.5%, 단핵체 85.7%, 큰느타리버섯 이핵체는 71.8%, 단핵체 72.2% 이상의 유사성을 나타내었다. 균주의 변이는 생장속도와 균주의 type과 관계가 있는 것으로 생각된다. 생장속도가 빠른 균주가 느린 균주보다 변이가 많이 나타난다는 것을 알 수 있었으며, 이핵균주보다는 단핵균주가 유전적으로 안전한 것으로 판단된다. 그러나, phylogenetic tree에서는 종, 균주 type, 균주 생장속도 및 계대배양 횟수와는 무관하게 branch가 분기되고, grouping 되었다. 결론적으로, 균사체의 많은 계대배양은 생장속도를 저하시키고, 유전적 변이를 야기시키는 요인으로 작용하며, 동일한 조건의 배양에서 이핵균주로 배양 보존하는 것보다는 단핵균주로 배양 보존하는 것이 종균제조와 육종에 유리한 것으로 사료된다.
Pleurotus ostreatus로부터 glyoxalase I(S-lactoyl-glutathione methylglyoxal lyase, EC 4.4.1.5)이 S-hexylglutathione affinity chromatography, Sephadex G-150 gel permeation chromatography, DEA-sepharose A-50 CL-6B ion exchange chromatography를 통해 순수 분리되었다. 이 결과, 전체 활성도의 21.7% fmf 수확하였으며, 분리 배수는 2,294 배 이었다. Gel filtration chromatography로 측정한 효소의 분자량은 34 kDa이며, SDS-PAGE 결과 본 효소는 분자량 17 kDa인 동일한 소단위체 두 개로 구성된 이합체라고 생각된다. Methylglyoxal과 phenylglyoxal에 대한 $K_m$ 값은 각각 0.39 mM 과 0.22 mM 이며 L-xylosone과 hydroxypyruvaldehyde에 대해서도 강한 친화력을 보여주었고, pH 6.5~7.5, $35~45^{\circ}C$에서 활성도가 가장 높았다. 이 효소의 반응 과정을 핵자기공 명분광법으로 분석한 결과, 분자내의 양성자 전달과정이 뚜렷이 관찰되었다.
Trichoderma속 균주는 느타리버섯 재배 시 발생되는 버섯 푸른곰팡이병의 주요 원인균이다. 후발효된 버섯 배지로부터 버섯 푸른곰팡이병균에 항균활성을 나타내는 길항세균(KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123)을 분리하였다. 분리세균 중 KATB 99121은 T. harzianum(4균주). T. viride 및 T. hamatum과 동물병원성 곰팡이 Candida albicans에 대하여 우수한 억제 활성이 관찰되었고, 특히 세균의 배양상등액 접종실험에서 강한 항균활성을 보였다. 또한, KATB 99121은 전분, 단백질 및 섬유소를 분해하는 효소를 세포외로 분비하는 것으로 관찰되었고, KATB 99122와 KATB 99123은 전분, 단백질, 섬유소 분해효소는 물론 지질 분해효소도 분비하고 있었으며 ${\beta}$-glucosidase활성도 높은 것으로 확인되었다. 앞으로 이들 길항세균들을 이용하여 느타리버섯 푸른곰팡이병 방제를 위한 미생물 살균제의 개발에 대한 연구를 수행할 예정이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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