• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제49권1호
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• pp.1-7
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• 2006

Differential display reverse transcription PCR (DDRT-PCR) analysis was performed on lily 'Marcopolo' bulb scale for isolation of expressed genes during bulblet formation. Cu/Zn lily-superoxide dismutase (LSOD) of 872 bp gene, with ability to scavenge reactive oxygen in stress environment, was isolated. Northern blot analysis showed expression levels of LSOD maximized 12 days after bulblet formation. Ti plasmid vectors were constructed with sense and antisense expressions of LSOD gene and transformed into potato. Southern blot analysis of transgenic potatoes revealed different copies of T-DNA were incorporated into potato genome. In transgenic potatoes, lily SOD gene was overexpressed in sense lines and not in antisense lines. In native polyacrylamide gel electrophoresis analysis, additional engineered LSOD was detected in sense overexpressed transgenic line only. Transgenic potatoes were subjected to oxidative stress, such as herbicide methyl viologen (MV). Transgenic potato lines with sense orientation exhibited increased tolerance to MV, whereas in antisense lines exhibited decreased tolerance. In vitro tuberization of transgenic potato with sense orientation was promoted, but was inhibited in transgenic potato with antisense orientation.

• KSBB Journal
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• 제17권2호
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• pp.162-168
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• 2002

본 연구에서는 유도성 promoter인 GAL1과 상시성 promoter인 GPD와 ADH1 promoter 하류에 사람 ferritin H-chain 유전자(hfL) 및 사람 ferritin L-chain 유전자(hfL)를 연결하여 재조합 plasmid를 구축하고 이들을 S. cerevisiae 2805에 형질 전환시켜 외래 유전자를 성공적으로 발현시켰다. Ferritin 발현에 미치는 promoter의 영향을 비교한 바, 이 두 단백질 생간에 있어서 GAL1 promoter가 GPD나 ABH1 promoter 보다 더 효율적이었다. GAL1 promoter를 사용한 형질 전환체 (YG-H와 YG-L)에서 H-chain의 발현율은 전체 수용성 단백질 중 4.5%에 해당하였고, L-chain의 발현율은 9.8%에 이르렀다. 각 균주에서 발현된 H 및 L subunit은 비변성 젤은 사용한 전기 영동의 결과 대장균에서 생산된 재조합 단백질과 마찬가지로 자발적으로 holoprotein으로 조합되어졌다. 재조합 H-와 L-ferritin들은 단백질 내공에 철을 축적할 수 있음이 Prussian blue 염색으로 확인되었다. 그리고 효모 세포를 10 mM ferric citrate를 함유한 배지에서 배양했을 때, H-ferritin과 L-ferritin을 생산하는 재조합 효모 균주에 있어서의 펄의 농도는 각각 174.9 $\mu\textrm{g}$ Per gram(dry cell weight)과 148.8 $\mu\textrm{g}$ Per gram(dry cell weight)이었고 야생형 효모 균주에 있어서의 털의 농도는 49.4 $\mu\textrm{g}$ Per gram(dry cell weight)이었다. 이것은 사람 ferritin 유전자를 효모 균주에 발현시킴으로써 효모의 철 함량이 증진되었음을 유추하는 결과이다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제32권3호
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• pp.205-209
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• 2008

본 연구는 돼지 $\beta$-casein 유전자 위치에서 EGFP가 발현될 수 있는 knock-in 벡터를 구축하기 위하여 실시되었다. 돼지의 $\beta$-casein 유전자를 이용하여 knock-in 벡터를 구축하기 위해 돼지의 태아 섬유아세포로부터 $\beta$-casein 유전자를 동정하였고 EGFP, SV4O polyA signal을 동정하였다. Knock-in 벡터는 5' 상동 영역 약 5 kb와 3' 상동 영역 약 2.7 kb로 구성되어있으며, positive selection marker로 $neo^{r}$ 유전자를, negative selection marker로 DT-A 유전자를 사용하였다. 구축된 knock-in 벡터로부터 EGFP의 발현을 확인하기 위하여 생쥐 유선 세포인 HC11 세포에 knock-in 벡터를 도입하였다. 그 결과 EGFP의 발현을 HC11 세포에서 확인하였다. 이와 같은 결과로서 이 block-in 벡터는 knock-in 형질전환 돼지를 생산하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제4권
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• pp.36-41
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• 1986

대장균(大腸菌)과 효모(酵母)의 셔틀 벡터인 YIp, YRp, YEp를 S. cerevisiae MC 16, DBY747에 형질전환(形質轉換)시켰다. 이들 벡터들을 대장균(大腸菌)에 형질전환(形質轉換)시켰을 때 그 빈도(頻度)가 YIp5, YIp26, YEp13, YRp7에서 각각 $5.1{\times}10^{-4}$, $1.5{\times}10^{-3}$, $3{\times}10^{-3}$, $1.3{\times}10^{-3}$으로 나타났다. YEp13을 MC16과 DBY747에 Ito 법(法)으로 형질전환(形質轉換)시켰을 때 MC16, DBY747에서의 빈도(頻度) 각각 $3.3{\times}10^{-4}$, $1.2{\times}10^{-4}$으로 나타났다. DBY747을 수용세포(受容細胞)로 하여 YRp7과 YIp26을 환상(環狀)으로 각각 형질전환(形質轉換)시켰을 때 그 빈도(頻度)는 각각 $3{\times}10^{-6}$, $6{\times}10^{-8}$이하로 나타났다. DBY747을 수용세포(受容細胞)로 하여 YEp13과 YIp26을 선상(線狀)으로 절단하여 $Li^+$ 처리(處理)한 S. cerevisiae에 cotransformation을 하였을 때 YIp26+YEp13 ($Leu^+$, $Ura^+$)의 cotransformant는 $1{\times}10^{-5}$ 빈도(頻度)가 나왔으며 YIp26과 YEp13에 대한 각각의 빈도(頻度)는 $10^{-7}$ 이하, $5{\times}10^{-5}$ 빈도(頻度)로 나타났다. 또 YIp5와 YEp13, YIp26과 YRp7을 원형질체화(原形質體化)한 S. cerevisiae DBY747에 cotransformation 하였을 때 빈도(頻度)는 YIp5+YEp13은 $4{\times}10^{-6}$으로 나오고 YIp26+YRp7에서 $1.5{\times}10^{-6}$으로 나타났다.

• 한국산림과학회지
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• 제87권2호
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• pp.164-172
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• 1998

Promoter가 없는 외래유전자를 이용하여 형질전환(形質轉換)시키고자 할 때의 최적조건(最適條件) 및 효율적인 형질전환체(形質轉換體)의 검정방법을 구명(究明)하고자 산림청(山林廳) 임목육종연구소(林木育種硏究所)에 식재된 잡종 포플러 양황철 62-9클론을 사용하여 재분화를 유도하고, 기내(器內) 형질전환실험(形質轉換實驗)을 실시하였다. 기내(器內)에서 식물체 재분화 유도를 위해서는 배지조성과 호르몬 농도의 조합이 가장 영향을 많이 끼치는 요인이었다. 여러 조합으로 엽조직 ($5{\times}5mm$ leaf strip)을 시료로 하여 MS 기본배지에 0, 0.01, 0.1, 0.5, $0.1mg/{\ell}$ NAA, 0.2, 0.5, 1.0, $2.0mg/{\ell}$ BAP를 혼합 처리하여 배양한 결과, $0.1mg/{\ell}$ NAA, $0.5mg/{\ell}$ BAP를 첨가한 호르몬 조합에서 즐기 분화율 및 explant당 분화된 부정줄기수가 상대적인 비율 94%(11.4개)로서 가장 높았다. 따라서 형질전환(形質轉換)된 엽조직(葉組織)을 재분화 시킬 때 이 조건을 줄기분화유도 배지 (SIM ; shoot-inducing medium)로 사용하였다. 선발유전자에 의한 항생제(抗生濟)의 선발농도(選拔濃度)를 알기 위해 pBI121로 형질전환(形質轉換)실험을 한 결과, cocultivation한 후 $100mg/{\ell}$ Km(kanamycin) 또는 $60mg/{\ell}$ G418(geneticin)이 첨가된 SIM 3 배지에서 2주가 경과하면서 육안으로 형질전환(形質轉換)된 부정아를 관찰할 수 있었고 이 부정아를 SIM 3로 옮긴지 6주 후에는 0.5-1cm 크기의 부정줄기로 자랐다. 그러나 대조(對照) 엽조직(葉組織)은 부정아형성이 거의 되지 않아, 선발유전자의 항생제(抗生濟) 선발농도(選拔濃度)는 이 조건이 최적임을 알 수 있었다. 또한 형질전환체(形質轉換體)의 재분화율을 높이기 위해 5-azacytidine을 처리한 결과, 항생제(抗生濟) 선발배지하에서 재분회율을 5.7%에서 26.7%까지 높일 수 있었다. Fluorometric 및 histochemical assay 방법으로 GUS 유전자의 활성(活生)을 검정한 결과 vector system간에 형질전환율(形質轉換率)이 서로 다름을 확인할 수 있었다. LBA4404/pBI121을 vector로 사용한 양황철의 기내(器內) 형질전환(形質轉換) 실험에서는 낮은 形짧훌훌換率(5.7%)을 보였다. 그러나 보다 응양성(應梁性)이 높은 super virulence 유전자를 포함하는 pEHA101을 helper plasmid로 하여 실험한 결과 형질전환율(形質轉換率)이 35.9%로 pAL4404보다 훨씬 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 promoter가 없는 외래유전자를 이용하여 promoter tagging을 하고자 할 때 형질전환(形質轉換)실험에는 helper plasmid로써 pEHA101을 이용하는 것이 적합한 것으로 판명되었다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제57권5호
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• pp.449-460
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• 2004

연구배경 : PS-341은 최근에 개발된 강력하고 특이적인 proteasome 억제제로서, 일부 암환자에 투여하여 좋은 성적이 보고되고 있다. Proteasome 억제제의 항암효과는 아포프토시스 유발 물질, 즉 p53, $p21^{WAF/CIP1}$, $p27^{KIP1}$, NF-${\kappa}B$, Bax, Bcl-2 등의 발현 증가와 관련이 있는 것으로 생각되고 있다. JNK와 GSK-$3{\beta}$도 아포프토시스에 관여하는 것으로 잘 알려져 있지만, PS-341에 의한 아포프토시스에서의 역할은 규명되지 못한 상태이다. 본 연구에서는 폐암세포주에서 PS-341에 의한 아포프토시스에서 JNK와 GSK-$3{\beta}$의 역할을 규명하고자 하였다. 방 법 : NCI-H157과 A549 폐암세포주를 실험에 사용하였다. 세포생존능은 MTT 방법으로 평가하였고, 아포프토시스는 PARP의 분해로 평가하였다. JNK의 활성도는 in vitro immuno complex kinase 방법과 내인성 c-Jun의 인산화로 측정하였다. 각종 단백의 발현은 Western 분석으로 평가하였다. JNK1과 GSK-$3{\beta}$의 과발현은 각각 plasmid vector와 adenovirus vector를 이용하였다. 결 과 : PS-341 처치로 아포프토시스에 의한 세포생존율의 감소가 관찰되었다. PS-341 처치로 JNK가 활성화되었고, c-Jun의 발현이 유도되었다. Dominant negative JNK1의 과발현 또는 SP600125 전치치로 JNK의 활성화를 차단하면 PS-341에 의한 아포프토시스가 억제되었다. PS-341 처리로 JNK 활성화에 의존적으로 caspase 3의 활성화가 유도되었다. Caspase 활성화의 차단으로도 PS-341에 의한 아포프토시스가 억제되었다. PS-341에 의해 Akt가 활성화되었고, Akt 활성화의 차단으로 PS-341에 의한 아포프토시스가 심화되었다. PS-341에 의한 Akt 활성화로 GSK-$3{\beta}$가 불활성화되었다. Constitutively active GSK-$3{\beta}$의 과발현으로 PS-341에 의한 아포프토시스가 심화되었고, dominant negative GSK-$3{\beta}$의 과발현으로 PS-341에 의한 아포프토시스가 감소되었다. Lithium chloride 전처치와 dominant negative GSK-$3{\beta}$의 과발현으로 PS-341에 의한 JNK의 활성화와 c-Jun의 발현 증가가 억제되었다. 결 론 : 폐암세포주에서 PS-341에 의한 아포프토시스는 JNK/caspase 경로가 관여하며, 이는 PI3K/Akt 경로를 통한 GSK-$3{\beta}$의 불활성화에 의해 억제되는 것으로 판단된다. 따라서 PS-341의 항암효과를 최대화하기 위해서는 PI3K/Akt 경로를 통한 GSK-$3{\beta}$의 불활성화를 차단하는 치료법이 병행되어야 할 것으로 판단된다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제32권7호
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• pp.922-929
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• 2019

Objective: Mutations in low-density lipoprotein receptor (LDLR), which encodes a critical protein for cholesterol homeostasis and lipid metabolism in mammals, are involved in cardiometabolic diseases, such as familial hypercholesterolemia in pigs. Whereas microRNAs (miRNAs) can control LDLR regulation, their involvement in circulating cholesterol and lipid levels with respect to cardiometabolic diseases in pigs is unclear. We aimed to identify and analyze LDLR as a potential target gene of SSC-miR-20a. Methods: Bioinformatic analysis predicted that porcine LDLR is a target of SSC-miR-20a. Wild-type and mutant LDLR 3'-untranslated region (UTR) fragments were generated by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the pGL3-Control vector to construct pGL3 Control LDLR wild-3'-UTR and pGL3 Control LDLR mutant-3'-UTR recombinant plasmids, respectively. An miR-20a expression plasmid was constructed by inserting the porcine premiR-20a-coding sequence between the HindIII and BamHI sites in pMR-mCherry, and constructs were confirmed by sequencing. HEK293T cells were co-transfected with the miR-20a expression or pMR-mCherry control plasmids and constructs harboring the corresponding 3'-UTR, and relative luciferase activity was determined. The relative expression levels of miR-20a and LDLR mRNA and their correlation in terms of expression levels in porcine liver tissue were analyzed using reverse-transcription quantitative PCR. Results: Gel electrophoresis and sequencing showed that target gene fragments were successfully cloned, and the three recombinant vectors were successfully constructed. Compared to pMR-mCherry, the miR-20a expression vector significantly inhibited wild-type LDLR3'-UTR-driven (p<0.01), but not mutant LDLR-3'-UTR-driven (p>0.05), luciferase reporter activity. Further, miR-20a and LDLR were expressed at relatively high levels in porcine liver tissues. Pearson correlation analysis revealed that porcine liver miR-20a and LDLR levels were significantly negatively correlated (r = -0.656, p<0.05). Conclusion: LDLR is a potential target of miR-20a, which might directly bind the LDLR 3'-UTR to post-transcriptionally inhibit expression. These results have implications in understanding the pathogenesis and progression of porcine cardiovascular diseases.