• BMB Reports
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• 제39권1호
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• pp.22-25
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• 2006

The gene encoding MPB83 from Mycobacterium bovis Vallee111 chromosomal DNA was amplified by using polymerase chain reaction (PCR) technique, and the PCR product was approximately 600bp DNA segment. Using T-A cloning technique, the PCR product was cloned into pGEM-T vector and the cloning plasmid pGEM-T-83 was constructed successfully. pGEM-T-83 and pET28a(+) were digested by BamHI and EcoRI double enzymes. The purified MPB83 gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-83 was constructed. Plasmid containing pET28a-83 was transformed into competence Escherichia coli BL21 (DE3). The bacterium was induced by isopropyl-$\beta$-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and its lysates were loaded directly onto sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), approximately 26 kDa exogenous protein was observed on the SDS-PAGE. The protein was analyzed using Western-blotting. The results indicated that the protein was of antigenic activity of M. bovis. The results were expected to lay foundation for further studies on the subunit vaccine and DNA vaccine of MPB83 gene in their prevention against bovine tuberculosis.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
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• 제17권
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• pp.59-63
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• 1999

벼의 엽록체 small HSP의 고온 스트레스 하에서의 기능을 밝히기 위하여 Oshsp21 cDNA를 pET 발현 vector에 도입하였다. 형질전환된 대장균 배양액에 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도시킨 다음 고온 stress 하에서의 생존율을 대조구와 비교하였다. 그 결과 대조균주의 경우 $50^{\circ}C$에서의 생존율이 크게 감소하였으나 Oshsp21이 발현된 대장균의 경우 70% 이상의 생존율을 나타내었다. 또한 대장균 단백질을 $55^{\circ}C$에서 30분간 열처리한 후, 대장균 단백질을 가용성과 비가용성 단백질로 분획한 다음, 각각의 비율을 조사한 결과, 대조균주의 경우 총 단백질의 약 60%가 비가용성 단백질로 변성되었으나, Oshsp21을 발현시킨 대장균의 경우 총 단백질의 약 35%만이 비가용성 단백질로 나타났다. 이러한 결과는 벼의 엽록체 small HSP는 세포내에서 분자 chaperone으로 기능하여 고온내성을 부여할 수 있음을 나타낸다.

• 미생물학회지
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• 제40권2호
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• pp.81-86
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• 2004

Streptomyces coelicolor의 전 유전체 청보를 분석한 결과(7), 유전자 ID1103135가 코드 하는 open reading frame SCO7697이 phytase[myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase상동성 (3-6,8,23)]에 유의하게 유사한 것으로 판단되었다. S. coelicolor A3(2)M의 염색체 DNA를 주형으로 PCR 방법으로 SCO7697 전체를 포함하는 DNA 단편을 클로닝하였다. 두 가지의 서로 다른 길이를 갖는 클로닝 된 ID1103135 DNA 단편을 E. coli 발현용 벡터pET728a(+)에 삽입하여,두 종의 재조합 벡터 pET28-SP와 pET28-LP를 얻었다. pET28-SP 와 pET28-LP를 각각 E. coli BL2l에 도입하여, IPTG로 발현 유도된 단백질을 SDS-polyacrylamide 전기영동으로 확인한 결과, 발현은 성공적으로 이루어 졌으나 대부분불용체를 형성하고 분자량은 예상보다 약간 큰 것으로 나타났다. 불용체 형성은 단백질의 불활성화를 수반 함으로서, 배양 온도를 $37^{\circ}C$에서 $30^{\circ}C$로 변화시켜 배양하는 방법으로 발현된 단백질을 가용화 시켰다. 발현된 단백질을 추출하여 조추출물 또는 정제한 상태로 phytase활성을 측청하였으나 효소활성은 관찰할 수 없었다. 대장균 시스템에서의 발현이 효소 활성의 소실을 초래했을 가능성이 있으므로, ID1103135 유전자를 자신의 promoter를 함유하도록 PCR 클로닝하여, E. coli - Streptomyces의 shuttle vector인 pWHM3에 삽입하고, 이를 방선균 호스트인 S. lividans에 도입하였다. 형질 전환체의 세포조추출액 및 세포배양액의 phytase 활성을 측청하였으나, 역시 활성을 확인할수 없었다. 이와 같은 결과는 SCO7697이 아주 높은 확률(E value; $6e^{-89}$)로 phytase일 것으로 annotation 되었으나, 실제는 이와는 다른 기능을 함유하고 있음을 시사하고 있다.

• KSBB Journal
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• 제13권6호
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• pp.662-668
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• 1998

Viruses belonging to the Hantavirus genus cause two acute severe illness in humans, i.e., Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome (HFRS) and Hantavirus Pulmonary Syndrome(HPS). Among them, Hantaan virus is one of the most important viruses causing HFRS. Recombinant expression vectors, pKK-NP and pET-NP, with Hantaan viral nucleocapsid gene were constructed, and used to transform Eschericia coli BL21(DE3). Stability of the vectors in the host strain, and effects of some environmental conditions on the expression of nucleocapsid gene were studied. Expression vector, pKK-NP, was very unstable, and the expression level of nucleocapsid gene was very low compared to that of pET-NP. BL21(pET-NP) produced about 100 mg of N protein per liter of culture broth. Induction time did not show any significant difference on the expression level of nucleocapsid gen and cell growth. BL21(pET-NP) culture at 35$^{\circ}C$ showed a little higher expression level than at 30$^{\circ}C$ during growth phase, but reached to the same level at stationary phase. Total expression level was proportional to supplemented glucose concentration of media up to 0.5% along with cell growth, but expression level per unit cell mass was inversely proportional to glucose concentration and maximal when glucose was not supplemented at all.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제44권2호
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• pp.140-144
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• 2016

사람의 분변으로부터 분리한 Bacteroides stericoris HJ-15로부터 chondroitinase ABC 유전자를 클로닝하였다. 클로닝한 chondroitinase ABC 유전자는 3,090 bp, 1,029 아미노산으로 구성되어 있었다. B. stercoris chondroitinase ABC 유전자는 이미 보고된 chondroitinase ABC 유전자들과 호몰로지가 없었으나, 아미노산서열에서는 82% 호몰로지를 보였다. T7 promoter를 가진 pET-26b+ expression vector에 클로닝한 chondroitinase ABC 유전자를 Escherichia coli BL21 (DE3)에서 발현하여 정제한 재조합 chondroitinase ABC는 chondroitin sulfate A, B 및 C를 모두 분해하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권2호
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• pp.103-110
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• 2003

그람 양성세균에서 PyrR단백질에 의하여 피리미딘의 생합성이 조절된다는 발견을 바탕으로 하여, Synechocystis sp.PCC6803과 Haemophilus influenzae의 PyrR orthologue 유전자를 Bacillus subtilis에서 형질전환 시켜 피리미딘 생합성의 조절 유무를 조사하였다. Synechocystis sp.PCC6803과 H. influenzae의 PyrR orthologue유전자를 pUC19과 T-vector에 클로닝 한후 pKH1, pKH2, pHPSK1, pHPSK2으로 각각 명명하였다. 이것을 다시 Escherichia. coli와 B. subtiius용 shuttle vector인 pHPS9에 클로닝 하여 pKH3, pKH4, pHPSK3, pHPSK4로 각각 명명하였다. B. subtilis DB104Δ PyrR에 pKH3, pKH4, pHPSK3, pHPSK4을 형질전환후 ATCase 활성을 측정결과 pHPSK3을 가진 균주만 피리미딘에 의한 조절작용이 일어난다는 사실을 통하여, H. influenzae의 PyrR orthologue 유전자의 선도 부분에 조절에 관여하는 미지의 부분이 있음을 예측할 수 있었다. 서로 다른 유래의 PyrR orthologue단백질을 정제하기 위하여 pET14b에 클로닝후 pKH5, pHPSK5으로 각각 명명하였다. SDS-PAGE로 분석한 결과 각각 약 18 kDa과 21 kDa의 분자량을 나타내었다. 정제된 PyrR orthologue 단백질의 UPRTase 활성을 측정한 결과 H. infuenzae의 PyrR orthologue 단백질은 UPRTase 활성을 나타내었으며 다양한 pH에서 측정한 결과 pH 5에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 반면에, Synechocystis sp. PCC6803의 PyrR orhologue 단백질은 UPRTase 활성을 나타내지 않았다. 여러 가지 균주의 PyrR 아미노산 서열을 비교한 계통수 분석은 PyrR 단백질의 조절기작과 어느 정도 연관됨을 시사해 주었다.

• KSBB Journal
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• 제32권1호
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• pp.16-21
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• 2017

The multiple sclerosis caused by multiple inflammatory disease or immune system disorder, is usually treated by interferon ${\beta}$ through adjusting the abnormal immune reactions. For high production of human interferon ${\beta}$ using recombinant E. coli, codon optimized and wild type genes were synthesized. When pET-15b or pET-21a vector was used as an expression vector with each gene, there was no target protein expression. When pQE30 vector was used as an expression vector, human interferon ${\beta}$ was expressed by recombinant E. coli XL1-blue and E. coli JM109. Using the codon optimized gene, the expression of human interferon ${\beta}$ was slightly increased as compared to that from wild type gene. However, most of expressed human interferon ${\beta}$ was insoluble form.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제50권2호
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• pp.177-184
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• 2008

Acid-labile subunit(ALS)는 85-kDa 크기의 당단백질로서 7.5-kDa의 insulin-like growth factor(IGF) 및 40~45-kDa IGF-binding protein-3와 결합하여 150-kDa ternary complex를 형성하는 혈장단백질이다. 선행연구에서 본 연구진은 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법으로 돼지(porcine) ALS(pALS)의 coding sequence를 합성하여 plasmid vector에 삽입시켜 ‘expression construct’를 제작한 바 있다. 그러나 본 expression construct의 pALS coding sequence에는 PCR error로 추정되는 원인으로 말미암아 2개의 bases에서 mis-sense mutation이 일어난 것이 발견되었다. 본 연구에서는 ‘site-directed mutagenesis’ 방법으로 pALS의 올바른 coding sequence를 합성하여 ‘insert DNA’의 마지막 codon 다음에 ‘His-tag’ sequence가 위치한 pET- 28a(+) plasmid expression vector에 삽입하였다. 본 expression construct는 E. coli BL21(DE3) 세포에서 ‘induction’ 시켰고, 발현된 유전자재조합(recombinant) peptide는 Ni-affinity chromato- graphy로 정제하였다. 이렇게 affinity chro- matography로 정제된 peptide는 SDS-PAGE에서 66kDa 위치에 single band를 나타냄으로써 recombinant pALS의 예상된 질량과 일치하였다. 이상의 결과는 본 연구에서 recombinant pALS peptide가 성공적으로 발현정제되었음을 시사한다.

• Molecules and Cells
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• 제26권6호
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• pp.616-620
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• 2008

Maintaining redox balance is one of the crucial requirements for a cell to endure stress from the outside. Dehydroascorbate reductase (DHAR; EC 1.8.5.1) plays an important role in the ascorbate-glutathione cycle; one of the major ROS scavenging systems in most known biological systems. A cDNA clone of the DHAR gene from Oryza sativa (OsDHAR) was isolated and overexpressed in Escherichia coli BL21 (DE3) strain from the pET-28a(+) expression vector. The OsDHAR transformed E. coli cells showed significantly higher DHAR activity and a lower level of ROS than the E. coli cells transformed by an empty pET-28a(+) vector. Also, the DHAR-overexpressing E. coli strain was more tolerant to oxidant- and heavy metal-mediated stress conditions than the control E. coli strain. The results suggest that the overexpressed rice DHAR gene effectively functions in a prokaryotic system and provide protection to various oxidative stresses.

• 산업기술연구
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• 제39권1호
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• pp.15-19
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• 2019

This work focused on characterization of the starch degradation activity from extremophile strain Deinococcus geothermalis. Glucoamylase gene from D. geothermalis was cloned and overexpressed by pET-21a vector using E. coli BL21 (DE3). In order to characterize starch degrading activity of recombinant glucoamylase, enzyme was purified using HisPur Ni-NTA column. The recombinant glucoamylase from D. geothermalis exhibited the optimum temperature as $45^{\circ}C$ for starch degradation activity. And highly acido-stable starch degrading activity was shown at pH 2. For further optimization of starch degrading activity with metal ion, various metal ions ($AgCl_2$, $HgCl_2$, $MnSO_4{\cdot}4H_2O$, $CoCl_2{\cdot}6H_2O$, $MgSO_4$, $ZnSO_4{\cdot}7H_2O$, $K_2SO_4$, $FeCl_2{\cdot}4H_2O$, NaCl, or $CuSO_4$) were added for enzyme reaction. As results, it was found that $FeCl_2{\cdot}4H_2O$ or $MnSO_4{\cdot}4H_2O$ addition resulted in 17% and 9% improved starch degrading activity, respectively. The recombinant glucoamylase from D. geothermalis might be used for simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process at high acidic conditions.