본 연구는 표고버섯균의 액체배양을 통한 protease효소의 최적생산 조건을 찾고, 생산된 protease 의 효소적 특성을 구명하고자 실시하였다. Protease 대량생산을 위한 공사균으로서 표고버섯균(Lentinula edodes)을 사용하였으며, 최적생산 조건을 구명하기 위하여 생산기질의 조성, 배양조건, 배양기간 등을 검토하였다. 배지의 조성별 protease 생산성에 있어서는 밀기울+옥수수가루+물+옥수수기름(WB+CF+W+CO)조합이 84.8 U/g으로서 가장 높은 protease 생산성을 보여주었고, 콩가루와 소맥분조합의 protease 생산성이 매우 낮은 것을 알 수 있었다. Protease 생산을 위한 배양매체로서 acetate buffer에서는 전혀 protease의 생산이 되지 않았으며, pH 6.2의 이온교환수가 80.5 U/g 의 가장 높은 protease 생산성을 나타냈다 이온교환수를 pH 4.0으로 조절하였을 때 생산성은 62.3 U/g 으로 낮아졌다. 배양기간에 따른 protease 생산성은 배양시간이 경과됨에 따라 증가하였으며, 72시간 배양으로 90.6 U/g 의 최대값에 달하였고, 그 이후 점차 감소하는 경향으로 나타났다 Sephadex G-75 chromatography 로 측정한 생산된 protease 의 분자량은 약 45,000 이었다. Lentinula edodes를 이용하여 생산된 protease의 효소특성을 상이한 pH 및 온도의 조건에서 조사한 결과, 최적 pH는 4에서 나타났으며, 37℃(1 시간)에서 측정한 활성은 pH 4~6 범위에 있었다. Protease의 온도안정성을 조사한 결과 최적온도는 55℃에서 나타났으며, 30~60℃의 넓은 온도범위에서 안정함을 알 수 있어서 이 효소는 소화용 제제, 식품공업, 맥주제조업 및 가죽무두질 등 널리 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
뽕나무버섯균의 배양적 특징 및 부후특성을 구명하고자 최적 (액체, 한천)배지 선발, 최적 온도 선정, 최적 pH 선정, 최적 톱밥배지를 선발하고, 세포벽 부후 특성을 관찰하였다. 그 결과 최적온도는 $20{\sim}27^{\circ}C$, 최적 pH는 고체 배지에서는 pH 5.0~6.5의 약산성에서 균사생장이 양호하였다. 최적 고체배지로는 ME와 PDA로 선발되었고, 최적 액체배지로는 glucose peptone이 선발되었다. 첨가제로는 탄소원인 lactose, mannitol, 질소원인 glutamic acid가 효과적인 것으로 나타났다. 뽕나무버섯균의 최적 톱밥배지 선발에 있어서 잣나무, 상수리나무, 졸참나무, 소나무에서 균사생육이 양호한 것으로 나타났으며, 삼나무에서 생장이 저조하였다. 뽕나무버섯균에 의해 부후된 침엽수재와 활엽수재 모두 전형적인 백색부후의 부후 형태를 나타내었다. 그러나 삼나무와 아카시나무의 부후는 상대적으로 미약하였다. 이상의 결과는 소나무류(Pinus sp.)의 톱밥이 뽕나무 버섯균의 재배기질로 적합함을 보여주며 일반적으로 흔히 구할 수 있는 저가의 제재부산물인 경송류의 톱밥을 재배 기질로의 활용가능성을 제시한다고 할 수 있다.
참나무 단목원목으로 재배한 P. linteus KACC93057P(PLHS)2년산 자실체 60%에탄올 추출물의 총 페놀함량은 $19.05{\pm}0.32mg\;GAE/g$로 다른 비교구 버섯 종에 비하여 4배에서 10배이상의 높게 나타났다. $125{\mu}g/mL$농도에서 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능은 62%와 100%를 나타냈으며 FRAP 환원력은 $0.7{\mu}MFeSO_4/g$으로 비교 구 버섯종 보다 2에서 10배이상의 유효활성이 검출 되었다. PLHS 자실체 ethyl acetate분배 추출물의 HPLC분석에서 styrylpyrone 계열의 화합물 davallialactone, hispidin, hypholomine B와 phenylpropanoid 계열의 화합물인 caffeic acid가 동정 되었다.
표고버섯 골목의 바이오에탄올 생산 자원으로서의 활용 가능성을 모색하고, 새로운 당화 공정으로 주목받고 있는 초임계수 가수분해 공정에 대한 기초 기술을 제공하기 위하여 버섯 골목으로 사용되는 상수리나무 정상재를 다양한 초염계수 가수분해 공정에 적용하고 분해산물의 분석을 실시하였다. 초임계수 가수분해 반응 시간 및 온도의 증가에 의하여 수용성 분해산물 및 비수용성 잔사의 색 진해짐, 분해율의 증가 그리고 비수용성 잔사의 결정화도가 증가하였다. 반응 압력의 증가는 낮은 반응 온도와 짧은 반응 시간 조건에서만 분해 산물의 색변화 및 분해율의 증가에 영향을 주었다 초염계수 가수분해는 반응 초기에 hemicellulose의 분해가, 반응 후기에는 cellulose 분해가 진행되었다. 반응 시간의 증가는 당화 수율을 향상시켰고 반응 온도의 증가는 $415^{\circ}C$까지는 당화 수율을 증가시켰지만 $415^{\circ}C$ 이상에서는 급격히 감소시켰다. 낮은 반응 온도조건에서 반응 압력의 증가는 당화 수율을 증가시컸지만, 높은 반응 온도 조건에서는 오히려 당화 수율을 감소시켰다. 확인된 당화 수율의 결과를 토대로 상수리나무 정상재의 최적 초엄계수 가수분해 조건은 $415^{\circ}C$, 23 MPa, 60초로 결정하였으며, 당화 수율은 2.68%로 확인되었다. 결정된 최적 조건에서 골목의 초임계수 가수분해를 실시한 결과 당화 수율이 3.58%로 정상재의 당화 수율보다 높았다. GC-MS를 이용한 수용성 분해산물의 분석 결과, 주요 분해 산물은 1,1'-oxybis-benzene과 1,2-benzendicarboxylic acid로 확인되었고, 낮은 분해율을 보인 반응 조건에서는 pentadecanoic acid, 14-methyl-heptadecanoic acid 등과 같은 지방산류가 공통적으로 검출되었다. 반응 온도 및 시간이 증가함에 따라 phenol, benzene류의 증가가 확연되었지만 비수용성 잔사에서는 반응 압력의 차이에 의한 분해 산물의 변화는 없었다. 비수용성 잔사의 성분 분석 결과 60.6~79.2%의 holocellulose를 함유하고 있었고, 산 촉매 가수분해에 의하여 49.2~67.5%의 당화 수율을 보여주었다. 희산을 이용한 수용성 분해산물의 2차 가수분해에 의하여 수용성 분해 산불 내 당화 수율이 큰 폭으로 향상되었다.
침엽수 톱밥을 이용한 표고버섯 재배용 인공골목에서 버섯 생산량과 질을 향상하기 위하여 균사생장에 적합한 배지재료의 조건, 목재성분 비교분석, 톱밥배지의 전처리, 다양한 첨가물들의 효능검토 등을 통해 인공기질 조성구축의 기본자료를 도출했으며 그 결과는 아래와 같다. 1. 수종별 톱밥배지 재료에 따른 균사생장 속도는 낙엽송>소나무 순이였으며 참나무와 이들 각각에 대한 목재성분을 비교분석한 결과, 전반적인 C/N ratio는 공통적으로 높게 나타났으나 참나무가 다른 침엽수에 비해 lignin과 arabinose, mannose 함량이 적고 xylose 함량이 높았으며, 낙엽송은 다른 수종에 비해 galactose의 함량이 상당히 높았다. 2. 각 배지재료의 전처리에 따른 균사생장속도를 측정한 결과, 폭쇄처리와 생물학적 처리시에는 control보다 오히려 균사생장 속도가 느렸으나, 배지를 냉수로 한번 씻어낸 경우에 전반적으로 좋은 결과를 보였다. 이를 토대로 각 처리를 시간별로 행한 결과 소나무는 온수로 1.5 hr, 낙엽송은 aceton으로 1.0 hr 추출시 균사생장이 가장 빨랐다. 3. 톱밥배지에 첨가하는 미강은 20% 이하가 적합했으나 균사생장에 미치는 효과가 일본에서 개발한 첨가제, BITEL의 약 80% 수준인 것으로 나타났으며, 이들 성분을 비교 분석한 결과 C/N 비는 유사하나 BITEL이 미강에 비해 xylose와 galactose 함량이 2배 이상 높았다. 4. 톱밥배지에서 표고균사의 생장을 촉진시키기 위하여 C원, N원 첨가효과를 조사한 결과, C원으로는 charcoal 3%, N원으로는 ammonium chloride와 potassium nitrate 0.02%가 좋았다. 5. 톱밥배지에 tannic acid의 첨가는 침엽수 뿐만 아니라 참나무에서도 균사생장에 별 다른 영향을 끼치지 못했으며, 1.5% 이상 첨가시에는 균사 생장이 오히려 지연되었다. 6. 침엽수 톱밥배지에 LSA(lignosulfonic acid)의 첨가효과를 조사한 결과, 소나무에서는 배지 건조중량의 1.5% 이하 첨가시 균사생장이 control보다 약 1.3배 정도 높았으나, 낙엽송 배지에서는 소량의 첨가에도 control보다 균사생장 속도가 느렸다.
2012년에 전국의 주요 천마재배 지역에 천마버섯 자실체 발생에 대한 조사를 하였다. 자실체 발생은 10월 17일경 거의 동시에 경기도 남양주, 경북 상주, 경북 김천에서 이루어졌다. 자실체가 발생한 지역과 주변 지역의 자실체 발생에 영향을 주는 시기인 버섯 발생 2주전의 온도 및 강수량을 조사하였다. 기온은 최저 $3{\sim}23^{\circ}C$, 최고 $15{\sim}26^{\circ}C$, 평균 $9.9{\sim}17.5^{\circ}C$였으며, 강수량은 10월 10일에 0.5~1.0mm, 10월 17일에 2.5~4.5mm를 기록하였다. 자실체 발생지는 5년 전에 천마를 재배하였고 지금은 다른 작물을 재배하는 지역으로 잡초가 많이 우거진 상태였다. 발생지는 경사가 15도 정도로 다소 있는 동향으로 양토로 이루어져 있었다. 천마를 재배한 밭과 이웃 밭 간의 작은 도랑을 중심으로 양쪽 옆으로 자실체가 많이 발생되었는데 수분이 항시 있고 잡초가 우거진 상태였다. 자실체는 참나무 원목이 아닌 토양위에서 발생하였다. 군생으로 발생도 하였지만 자실체가 1-5개 정도로 산발적으로 발생하기도 하였다. 자실체 발생지를 자세히 살펴본 결과 간혹 검정색의 굵은 균사속을 따라 자실체가 발생한 것을 알 수 있었으며, 자실체를 뽑아보니 자실체 기부에 균사속이 붙어 있는 것이 관찰되었다.
본 연구는 표고의 톱밥재배시 재배배지의 숙도, 자실체 발생단계 및 버섯생산 수량을 정량화하고 예측하고자 실시하였다. 배지의 성숙도는 자실체 발생시기를 결정하는데 매우 유용한 지표로서, 균주, 영양생장기간, 여러 가지 효소의 활성이 관여하며, 배지내의 성분변화, pH 변화 및 수분포텐셜 등이 영향한다. 자실체발생 초기에 배지내의 glucosamine 의 함량이 최고치를 나타냈으며, 자실체 발생후 신속히 감소하였다. lipid phosphate 및 ergosterol 함량도 버섯원기 형성 시에 높은 값을 보였으며, 자실체 발생직전 최고값에 달하였다. 따라서 lipid phosphate 및 ergosterol 함량이 배지의 숙도 및 자실체형성을 예측하는 주요수단으로 사용될 수 있다. 기질내의 pH는 종균접종전 6.3으로부터 자실체형성단계에서 4.0으로 변화하였으며, pH측정으로 자실체수량을 예측할 수 있었는데, 이러한 pH를 bromphenol blue(BPB)의 스프레이로 간단히 측정할 수 있었다. 아울러 기질의 수분포텐셜과 관련하여, -0.5MPa 정도의 수분포텐셜감소가 생장 및 자실체형성에 크게 영향하였으며, 우수한 숙도외 버섯재배 기질이 가지는 수분포텐셜은 버섯발생 전후 각각 -0.7MPa, -4.0MPa 였다. 높은 수분포텐셜은 고밀도의 균체콜로니를 만들 수 있었으며 균주 및 배양기간중의 상호작용이 기질의 수분포텐셜에 현저히 영향하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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