• 한국버섯학회지
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• 제20권3호
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• pp.178-182
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• 2022

버섯의 오랜 역사에도 불구하고 버섯의 유전적 기능과 분자유전학을 응용한 신품종 개발에 대한 연구는 크게 부족한 상황이다. 그러나 최근 유전자 가위인 CRISPR/Cas를 이용한 새로운 유전자 교정 기술이 개발됨에 따라 버섯 연구에서 이 기술을 이용한 다양한 시도가 이루어지고 있다. 특히 선택의 용이성을 위해 외래 유전자 삽입 없이도 고효율로 유전자 편집이 가능한 RNPs를 활용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 RNPs는 원형질체의 세포막을 통과하기에 Cas9이 너무 거대하고 guide RNA가 쉽게 파괴된다는 단점을 가지고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 세포막 통과에 용이한 미네랄 성분인 CaP와 PAA를 조합하여 Nanoparticle을 형성함으로써 극복하고자 했다. 표고버섯 단핵 균주인 산조705-13을 이용하여 원형질체 분리에 적합한 Osmotic buffer를 찾기 위하여 0.6M과 1.2M의 Sucrose, Sorbitol, Mannitol, KCl을 처리하였고 그 결과 0.6M Sucrose가 가장 적합한 osmotic buffer임을 확인하였다. 또한 CaP으로 RNPs와 Nanoparticle 복합체를 형성하고 이 복합체가 RNase A로부터 RNPs의 기능을 온전히 보호하는 것을 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제24권12호
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• pp.1269-1275
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• 2014

TALEN은 특정유전자를 표적 하여 knock-out 시킬 수 있는 새로운 개념의 유전자 클로닝 방법이다. TALEN 플라스미드에는 DNA binding 도메인과 Fok1 절단효소 기능이 융합되어 있기 때문에, genomic DNA 의 어느 부위라도 결합할 수 있고, 표적 염기서열을 절단하여 유전자 돌연변이를 유도할 수 있다. 본 연구에서 우리는 SETDB1 HMTase 유전자의 단백질 개시코돈 과 프로모터 -25 upstream 부위를 표적 하는 두 종의 TALEN constructs 를 제작하였다. 이를 위하여 두 단계의 클로닝이 진행되었다. 첫 번째는 모듈벡터에서 pFUS배열벡터로 표적서열을 옮겨 콜로니 PCR을 통해 smear밴드와 Esp1 제한 효소를 이용하여 약 1 kb의 insert가 들어 있음을 확인하였다. 두 번째는 배열 벡터로부터 TALEN 발현벡터로 옮기는 과정을 진행하였으며, 염기서열분석을 통해 확인하였다. 그 결과 최초의 고안된 모듈벡터 서열들이 약 100 bp 간격으로 배열되어 있음을 확인하였다. 제작된 TALEN-DBEX2 construct는 transfection을 통해 SETDB1의 발현이 사라지는 것을 확인하였고, T7E1 분석을 통하여 표적부위에서 돌연변이가 발생하였음을 추정할 수 있었다. 한편, TALEN-DBPR25 transfection을 통하여서도 SETDB1의 발현이 감소하는 현상을 확인 하였다. DBEX2, DBPR25를 이입시킨 HeLa 세포에서 세포 형태가 길어지는 현상을 관찰할 수 있었다. 그러므로 단백질 개시코돈 또는 -25 upstream을 표적 하는 TALEN knock-out 방법은 SETDB1 유전자의 기능연구에 매우 유용하다고 사료된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제23권4호
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• pp.545-554
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• 2013

Plasmid isolation of kimchi-derived Weissella cibaria KLC140 revealed six different plasmids. The smallest plasmid, pKW2124, was DNA sequenced and characterized, showing 2,126 bp with a GC content of 36.39% and five putative open reading frames (ORFs). In silico analysis of these ORFs showed ORF1 encodes a putative replication protein similar to rolling circular replication proteins from other lactic acid bacteria. However, a single-stranded intermediate was not detected when S1 nuclease was treated, suggesting it may follow theta replication. Interestingly, the replication initiation site of this plasmid is 100% identical to other plasmids from lactic acid bacteria, suggesting it may function for replication initiation. To construct a surface layer expression vector, pTSLGFP, slpA encoding the surface layer protein from Lactobacillus acidophilus was PCR amplified and fused with the gfp gene, forming a SLGFP fused gene. The plasmid pKW2124 was cloned into the XbaI site of pUC19, forming an Weissella-E. coli shuttle vector pKUW22. NheI-linearized pTSLGFP was ligated into pKUWCAT containing pKUW22 and the chloramphenicol acetyltransferase gene from pEK104, resulting in an 8.6 kb pKWCSLGFP surface layer expression vector. After transformation of this vector into W. cibaria KLC140, a GFP fluorescence signal was detected on the surface of the transformant, substantiating production of SLGFP fused protein and its secretion. This is the first report for construction of a Weissella surface layer expression vector, which may be useful for surface layer production of beneficial proteins in Weissella.

• 대한화학회지
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• 제43권3호
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• pp.307-314
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• 1999

대장균의 RNase P의 RNA 성분인 M1 RNA는 대장균 rnpB 유전자의 주요한 일차전사물인 선구-M1 RNA로부터 3'가공으로 생성된다. 이 가공 활성을 가지고 있는 효소 분획을 부분 정제하고 그 특성을 조사하였다. 이 활성 분획을 높은 염농도에 노출시키면 가공 활성이 불활성화하는 것으로 보아, 가공효소는 여러 효소로 이루어진 효소 복합체인 것으로 추정된다. 이 효소 분획은 화학적 핵산 가수분해효소인 납(II) 이온으로 처리하면 효소 활성을 잃지만, 효소 분획 자체에서 추출한 RNA를 가하면 효소 활성을 되찾는다. 이 결과는 효소 활성에는 RNA 분자가 필요하다는 것을 시사한다. 부분 정제한 효소로 형성되는 절단자리들의 분석 결과도, 3'가공과정이 여러 효소에 의하여 일어나고, 적어도 두 가지 다른 경로로 일어난다는 것을 암시한다.

• Molecules and Cells
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• 제39권7호
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• pp.530-535
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• 2016

Large conductance calcium-activated potassium (BK) channels participate in many important physiological functions in excitable tissues such as neurons, cardiac and smooth muscles, whereas the knowledge of BK channels in bone tissues and osteoblasts remains elusive. To investigate the role of BK channels in osteoblasts, we used transcription activator-like effector nuclease (TALEN) to establish a BK knockout cell line on rat ROS17/2.8 osteoblast, and detected the proliferation and mineralization of the BK-knockout cells. Our study found that the BKknockout cells significantly decreased the ability of proliferation and mineralization as osteoblasts, compared to the wild type cells. The overall expression of osteoblast differentiation marker genes in the BK-knockout cells was significantly lower than that in wild type osteoblast cells. The BK-knockout osteoblast cell line in our study displays a phenotype decrease in osteoblast function which can mimic the pathological state of osteoblast and thus provide a working cell line as a tool for study of osteoblast function and bone related diseases.

• Animal Bioscience
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• 제36권6호
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• pp.973-979
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• 2023

Objective: The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system, which is the most efficient and reliable tool for precisely targeted modification of the genome of living cells, has generated considerable excitement for industrial applications as well as scientific research. In this study, we developed a gene-editing and detection system for chick embryo sexing during the embryonic stage. Methods: By combining the CRISPR/Cas9 technical platform and germ cell-mediated germline transmission, we not only generated Z chromosome-targeted knockin chickens but also developed a detection system for fluorescence-positive male chicks in the embryonic stage. Results: We targeted a green fluorescent protein (GFP) transgene into a specific locus on the Z chromosome of chicken primordial germ cells (PGCs), resulting in the production of Z^GFP-knockin chickens. By mating Z^GFP-knockin females (Z^GFP/W) with wild males (Z/Z) and using a GFP detection system, we could identify chick sex, as the GFP transgene was expressed on the Z chromosome only in male offspring (Z^GFP/Z) even before hatching. Conclusion: Our results demonstrate that the CRISPR/Cas9 technical platform with chicken PGCs facilitates the production of specific genome-edited chickens for basic research as well as practical applications.

• Applied Biological Chemistry
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• 제38권5호
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• pp.387-392
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• 1995

대두 glycinin 유전자의 조직 특이적이고 분화 발달 특이적인 발현 조절 메카니즘을 연구하기 위하여 Gy2 유전자의 5' upstream 부위 염기서열을 조사한 결과, glycinin 유전자의 발현을 조절하는 인자로 여겨지는 여러 가지 조절 인자들을 발견하였다. 진핵세포 유전자에 공통적으로 존재하는 TATA box와 AGGA box가 존재하고, 종자 저장 단백질에서 공통적으로 발견되는 embryo factor binding sequence, RY repeat CACA sequence, ${\beta}$-conglycinin enhancer 와 유사한 sequence 등이 발견되었다. 이러한 조절 요소들이 Gy2 유전자의 발현 조절에 미치는 영향을 알아보기 위해 Gy2유전자의 5' upstream부위를 Exo III nuclease와 여러가지 제한효소를 이용하여 일련의 deletion mutants를 제조한 후 GUS 유전자와 결합시켰다. 이들 여러가지 chimeric constructs를 대두 원형질체에 전입하고 원형질체로부터 추출물을 분리하여 GUS 활성을 조사한 결과, $-28l{\sim}-223$ 혹은 $-l70{\sim}-122$ 부위를 포함하였을 경우 활성이 감소하였고, $-223{\sim}-170$ 혹은 $-l22{\sim}-16$ 부위를 포함하였을 경우 활성이 높게 나타났다. 이러한 Gy2 유전자의 이중적인 발현 양상은 glycinin 유전자의 발현조절에 음성 조절 요소와 양성 조절 요소가 관여하고있다는 사실을 제시해 주고 있다. 또한 이들 여러가지 chimeric constructs로 형질 전환된 담배의 종자와 잎에서 GUS활성을 조사한 결과, CaMV promoter를 포함하는 chimeric construct는 종자와 잎에서 모두 활성을 나타냈으나, Gy2 Promoter를 포함하는 chimeric constructs는 종자에서만 GUS 활성을 나타내고 잎에서는 활성이 나타나지 않는 조직 특이적인 발현 양상을 나타내었다.