• 생명과학회지
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• 제30권3호
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• pp.304-312
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• 2020

한천분해효소(agarase)는 기초과학영역, 한천유래 고기능성 올리고당의 생산, 해조류를 이용한 바이오에너지 생산 등에 사용될 수 있다. 본 연구진은 2012년에 한천의 분류, 기원, 생산 및 응용에 관하여 총설하였다. 이에 본고에서는 2012년부터의 agarase 재조합 발현에 대해 총설하고자 한다. Agarase의 재조합 발현에 사용된 유전자는 Agarivorans 속(genus) 세균, Flameovirga 속 세균, Pseudoalteromonas 속 세균, Gayadomonas 속 세균, Catenovulum 속 세균, Microbulbifer 속 세균, Cellulophaga속 세균, Saccharophagus 속 세균, Simiduia 속, Vibrio 속 세균 등의 19종의 세균들에서 유래하였다. 47개의 재조합 발현된 agarase 중에서 α-agarase는 2개였고 나머지는 모두 β-agarase 였다. α-Agarase는 모두 agarotetraose (A4)를 생산하였고 β-agarase는 NA2부터 NA12까지 다양한 산물을 생산하였다. 최적온도는 25~60℃, 최적 pH는 3.0~8.5의 범위였다. 50℃ 이상의 최적 온도를 갖는 agarase는 14개로 이들은 한천을 가열한 후에 졸상태가 유지되는 온도에서도 활발한 활성을 보일 것이다. CBM (carbohydrate-binding module)의 조작 등의 인위적 돌연변이로 agarase의 열안정성 증가, 최적온도와 활성의 동시 증가에 관한 연구 사례도 있었다. 재조합발현의 숙주로 E. coli, B. subtilis, S. lividans, S. cerevisiae 등이 활용되었으며, agarase 유전자의 분비신호, 다른 생물의 분비신호 및 riboswitch가 agarase의 재조합 발현에 사용되었다. Agarase를 정제한 후에 아미노산 서열에 기반한 유전자 재조합 이외에도 게놈서열 파악과 유사성 비교를 통해 putative agarase와 메타게놈에서 유래한 agarase의 재조합 발현에 관한 연구도 있다. 이러한 연구들은 향후 agarase 및 agarase를 이용한 한천분해산물의 응용 분야 등에 활발하게 이용될 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제32권10호
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• pp.778-783
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• 2022

본 연구에서는 해양 한천분해세균인 Simiduia sp. SH-2을 분리하여 생장과 agarase의 특성을 조사하였다. 경상남도 남해군 미조면 연안에서 채취한 해수를 Marine agar 2216 배지에 도말하여 한천분해활성을 보이는 SH-2 균주를 분리하였다. 선택된 SH-2 균주는 16S rDNA 염기서열분석을 통해 Simiduia sp. SH-2로 명명하였다. Simiduia sp. SH-2 균주의 배양액으로부터 한천분해효소를 획득하여 한천분해활성을 측정하였다. Simiduia sp. SH-2 유래 한천분해효소의 최고활성은 625 U/l로 나타났다. 한천분해활성은 40℃에서 최고치를 나타내었으며, 40℃에서의 활성을 100%로 하였을 때 20℃에서 31%, 30℃에서 71%의 상대활성을 나타내었다. 최적 pH는 pH 7.0으로 pH 7.0의 활성을 100%로 하였을 때 pH 6.0과 pH 8.0에서 각각 94%와 89%의 상대활성을 나타내었다. 한천분해효소는 20, 30℃에서 2시간 동안 열처리한 후에도 96%의 잔존활성을 나타내었고, 40℃에서 2시간 동안 열처리한 후에도 49%의 잔존활성을 나타내었다. Simiduia sp. SH-2는 neoagarotetraose 및 neoagarohexaose 등의 neoagarooligosaccharides를 생성하여 β-agarase를 생산하는 균주로 확인되었다. 따라서 Simiduia sp. SH-2 균주와 이 균주의 β-agarase는 식품, 화장품, 의약품 산업에서 기능성 소재의 생산자로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권12호
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• pp.1692-1697
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• 2012

We report a glycoside hydrolase (GH)-118 ${\beta}$-agarase from a strain of Agarivorans, in which we previously reported recombinant expression and characterization of the GH-50 ${\beta}$-agarase. The GH comprised an open reading frame of 1,437 base pairs, which encoded a protein of 52,580 daltons consisting of 478 amino acid residues. Assessment of the entire sequence showed that the enzyme had 97% nucleotide and 99% amino acid sequence similarities to those of GH-118 ${\beta}$-agarase from Pseudoalteromonas sp. CY24, which belongs to a different order within the same class. The gene corresponding to a mature protein of 440 amino acids was inserted, recombinantly expressed in Escherichia coli, and purified to homogeneity with affinity chromatography. It had maximal activity at $35^{\circ}C$ and pH 7.0 and had 208.1 units/mg in the presence of 300 mM NaCl and 1 mM $CaCl_2$. More than 80% activity was maintained after 2 h exposure to $35^{\circ}C$; however, < 40% activity remained at $45^{\circ}C$. The enzyme hydrolyzed agarose to yield neoagarooctaose as the main product. This enzyme could be useful for industrial production of functional neoagarooligosaccharides.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제26권9호
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• pp.1650-1656
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• 2016

The SCO0284 gene of Streptomyces coelicolor A3(2) is predicted to encode an α-galactosidase (680 amino acids) belonging to glycoside hydrolase family 27. In this study, the SCO0284 coding region was cloned and overexpressed in Streptomyces lividans TK24. The mature form of SCO0284 (641 amino acids, 68 kDa) was purified from culture broth by gel filtration chromatography, with 83.3-fold purification and a yield of 11.2%. Purified SCO0284 showed strong activity against p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside, melibiose, raffinose, and stachyose, and no activity toward lactose, agar (galactan), and neoagarooligosaccharides, indicating that it is an α-galactosidase. Optimal enzyme activity was observed at 40℃ and pH 7.0. The addition of metal ions or EDTA did not affect the enzyme activity, indicating that no metal cofactor is required. The kinetic parameters V_max and K_m for p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside were 1.6 mg/ml (0.0053 M) and 71.4 U/mg, respectively. Thin-layer chromatography and mass spectrometry analysis of the hydrolyzed products of melibiose, raffinose, and stachyose showed perfect matches with the masses of the sodium adducts of the hydrolyzed products, galactose (M+Na, 203), melibiose (M+Na, 365), and raffinose (M+Na, 527), respectively, indicating that it specifically cleaves the α-1,6-glycosidic bond of the substrate, releasing the terminal D-galactose.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권10호
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• pp.1197-1200
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• 2009

The whitening effect, tyrosinase inhibition, and cytotoxicity of neoagarotetraose were measured after its purification from hydrolyzed agar by gel filtration chromatography. In melanoma B16F10 cells, the melanin content of neoagarotetraose-treated cells was the same as that treated by kojic acid or arbutin. In addition, tyrosinase of melanoma cells was strongly inhibited by neoagarotetraose at a concentration of $1{\mu}g/ml$ and similarly inhibited at 10 and $100{\mu}g/ml$ compared with those by arbutin or kojic acid. The activity of mushroom tyrosinase showed a 38% inhibition by neoagarotetraose at $1{\mu}g/ml$, and this inhibitory effect was more efficient than that by kojic acid. Neoagarotetraose revealed a similar $IC_{50}$ (50% inhibition concentration) value for mushroom tyrosinase as that by kojic acid. These data suggest that the neoagarotetraose generated from agar by recombinant $\beta$-agarase might be a good candidate as a cosmetic additive for the whitening effect.

• 생명과학회지
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• 제29권11호
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• pp.1173-1178
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• 2019

본 연구에서는 agarose를 분해하는 세균을 분리하고 한천분해효소의 특성을 조사하였다. 한천분해세균인 BK-1은 부산광역시 수영구 광안리해수욕장에서 채취한 바닷물-시료에서 Marine agar 2216 평판배지를 이용하여 분리하였다. 분리된 균은 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 통해 Agarivorans sp. BK-1으로 명명하였다. 세포 외 agarase는 Agarivorans sp. BK-1 균주 배양액에서 획득하였으며, 이를 이용하여 효소의 특성을 조사하였다. Agarivorans sp. BK-1 균주의 한천분해효소는 20, 30, 40, 50, 60 및 $70^{\circ}C$에서 각각 67, 93, 97, 100, 58, 52%의 상대활성을 나타냈으며, pH 5, 6, 7, 8에서는 59, 100, 95, 91%의 활성을 나타내었다. 세포 외 agarase는 $50^{\circ}C$에서 pH 6.0인 20 mM Tris-HCl 완충용액을 사용하였을 때 최대의 활성을 보였다. 이 agarase는 20, 30, $40^{\circ}C$에서 2시간 동안 열처리하여도 90% 이상의 잔존활성을 보였다. 또한, $50^{\circ}C$에서 2시간 동안 노출된 후에도 56%의 잔존활성을 보였다. 60과 $70^{\circ}C$에서 30분 동안 노출된 후에는 효소활성 대부분이 사라졌다. Zymogram 분석을 통하여 Agarivorans sp. BK-1 균주가 약 110, 90, 55 kDa 크기의 한천분해효소들을 생산하는 것을 확인할 수 있었다. TLC 분석 결과, Agarivorans sp. BK-1 균주의 한천분해효소는 네오한천올리고당인 neoagarobiose (46.8%), neoagarotetraose (39.7%) 및 neoagarohexaose (13.5%)를 생성하는 것으로 보아 ${\beta}$-agarase로 확인되었다. 따라서 Agarivorans sp. BK-1가 생산하는 ${\beta}$-agarase는 보습효과, 세균성장 억제, 미백효과, 식품, 화장품 및 전분노화 방지 등의 기능을 가지는 네오한천올리고당의 생산에 유용할 것으로 판단된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제43권2호
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• pp.134-141
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• 2015

대한민국 대천 해수로부터 agarase를 생산하는 균주 H9을 분리하였다. 본 균주는 16S rRNA 염기 염기서열 분석결과로부터 Pseudoalteromonas espejiana NCIMB2127^T (98.98%), Pseudoalteromonas carrageenovora ATCC12662^T (98.78%), Pseudoalteromonas atlantica IAM12927^T (98.64%), Pseudoalteromonas issachenkonii KMM3549^T (98.63%) 등과 높은 상동성을 보였다. 균주 H9은 genomic DNA 내 G+C 농도가 41.56%이고 주요 퀴논으로 quinone-8을 포함하고 있다. 균주 H9의 주요 지방산으로 C_16:1ω7c (34.3%), C_16:0 (23.72%), C_18:1ω7c (13.64%) 등이 포함되었다. 이러한 유전적, 생리적 특성에 따라 균주 H9은 Pseudoalteromonas 속의 균으로 분류하여 Pseudoalteromonas sp. H9으로 명명하였다. 균주 H9이 세포외부로 분비하는 총 agarase는 40-45℃와 pH 7.0-8.0의 조건에서 높은 효소 활성을 갖으며, agarose를 분해하여 (neo)agarotetraose와 (neo)agarohexaose를 생산하였다. 균주 H9은 한천분해를 위해 유용하게 사용될 수 있으며, 다양한 생리활성을 갖는 (neo)agarooligosaccharide는 기능성 식품, 화장품 등의 산업에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제22권11호
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• pp.1545-1551
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• 2012

이전 연구에서 저자들이 Glycoside hydrolase family 50 (GH-50)과 GH-118 ${\beta}$-agarase들의 발현과 특성을 보고한 Agarivorans sp. JA-1 균주로부터 신규의 GH-16 ${\beta}$-agarase를 보고하고자 한다. 본 유전자는 1,362 염기쌍으로 구성되어 있으며, 453 아미노산 잔기로 구성된 49,830 Da의 단백질을 암호화한다. 본 효소는 Pseudoalteromonas sp. CY24 유래의 GH-16 ${\beta}$-agarase와 98%의 염기서열 상동성과 99%의 아미노산서열 상동성을 나타냈다. 신호서열을 제외한 429 아미노산으로 구성된 성숙단백질에 해당하는 유전자를 E. coli BL21 (DE3) 세포에서 재조합 발현시킨 후, 친화성 크로마토그래피로 효소를 정제하였다. 정제된 효소는 $40^{\circ}C$와 pH 5.0에서 67.6 U/mg의 최적 활성을 보였다. 아가로스를 기질로 한 효소분해산물의 박막크로마토그래피 분석결과, neoagarohexaose와 neoagarotetraose가 주산물로 생산되는 것을 알 수 있었다. 본 효소는 기능성 한천올리고당의 산업적 생산에 활용 가능할 것으로 기대된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제42권4호
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• pp.324-330
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• 2014

한천을 분해하는 해양미생물을 한천을 유일한 탄소원으로 하는 인공 해수 한천 배지를 이용하여 제부도 개펄에서 분리하였다. SH-1으로 명명한 분리된 균주는 그람음성균이며 한 개의 극성 편모를 가지는 균이었다. 16S rRNA 유전자의 염기서열의 유사성 분석 결과 분리된 균주는 Neiella marina J221 [9]과 가장 높은 상동성을 보였다(96.5%). 분리 균주는 $28-37^{\circ}C$에서 생장하였지만 $42^{\circ}C$에서는 생장하지 못하였고 한천분해효소의 활성은 $37^{\circ}C$보다 $28^{\circ}C$에서 높은 활성을 보였다. 또한 SH-1균주는 1-5% NaCl (w/v)를 포함하는 배양액에서 생장이 가능했으며 3%의 농도에서 가장 좋은 생장을 보였고 한천을 분해하는 효소의 활성도 3% 염분농도의 배양액에서 가장 높았다. 48시간 배양한 세포배양액을 농축하여 조효소액을 준비하여 효소의 적정 pH와 적정 온도를 조사한 결과 pH 7.0에서와 $40^{\circ}C$에서 최적 효소 활성을 보였다. 조효소액을 사용하여 zymogram 분석을 실시한 결과 분자량 15, 35, 52 KD 크기의 3개 이상의 한천 분해효소를 생산하는 것으로 보인다. 박막크로마토그라피(TLC) 분석 결과 아가로스를 분해하여 네오올리고당을 생성하는 ${\beta}$-agarase 를 생산하는 것으로 추정된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제30권11호
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• pp.1659-1669
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• 2020

1,3-α-3,6-anhydro-L-galactosidase (α-neoagarooligosaccharide hydrolase) catalyzes the last step of agar degradation by hydrolyzing neoagarobiose into monomers, D-galactose, and 3,6-anhydro-L-galactose, which is important for the bioindustrial application of algal biomass. Ahg943, from the agarolytic marine bacterium Gayadomonas joobiniege G7, is composed of 423 amino acids (47.96 kDa), including a 22-amino acid signal peptide. It was found to have 67% identity with the α-neoagarooligosaccharide hydrolase ZgAhgA, from Zobellia galactanivorans, but low identity (< 40%) with the other α-neoagarooligosaccharide hydrolases reported. The recombinant Ahg943 (rAhg943, 47.89 kDa), purified from Escherichia coli, was estimated to be a monomer upon gel filtration chromatography, making it quite distinct from other α-neoagarooligosaccharide hydrolases. The rAhg943 hydrolyzed neoagarobiose, neoagarotetraose, and neoagarohexaose into D-galactose, neoagarotriose, and neoagaropentaose, respectively, with a common product, 3,6-anhydro-L-galactose, indicating that it is an exo-acting α-neoagarooligosaccharide hydrolase that releases 3,6-anhydro-L-galactose by hydrolyzing α-1,3 glycosidic bonds from the nonreducing ends of neoagarooligosaccharides. The optimum pH and temperature of Ahg943 activity were 6.0 and 20℃, respectively. In particular, rAhg943 could maintain enzyme activity at 10℃ (71% of the maximum). Complete inhibition of rAhg943 activity by 0.5 mM EDTA was restored and even, remarkably, enhanced by Ca²⁺ ions. rAhg943 activity was at maximum at 0.5 M NaCl and maintained above 73% of the maximum at 3M NaCl. K_m and V_max of rAhg943 toward neoagarobiose were 9.7 mg/ml and 250 μM/min (3 U/mg), respectively. Therefore, Ahg943 is a unique α-neoagarooligosaccharide hydrolase that has cold- and high-salt-adapted features, and possibly exists as a monomer.