• 한국수정란이식학회지
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• 제25권4호
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• pp.251-258
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• 2010

In the present study, effects of concentration and time of culture in presence of roscovitine on nuclear maturation and meiotic spindle configuration, chromosomal alignment were examined in porcine oocytes. In experiment 1, porcine cumulus oocyte complexes (COCs) were cultured at $39^{\circ}C$ in a 5% $CO_2$ atmosphere in North Carolina State University 23 (NCSU-23) supplemented with 25, 50, 75 or $100\;{\mu}M$ roscovitine for 22 h and then were cultured for additional 22 h after removal of roscovitine. Nuclear maturation and morphology of the meiotic spindle and chromosomal alignment were examined to determine the optimal concentration of roscovitine in oocyte maturation. In experiment 2, COCs were cultured in NCSU-23 supplemented with $50\;{\mu}M$ roscovitine for 17, 20, 27 or 42 h and then an additional 22 h without roscovitine was followed to determine the optimal time of culture. The optimal concentration of roscovitine to arrest and resume meiosis of porcine oocyte was $50\;{\mu}M$ by examining nuclear status (p<0.05) and normal spindle and chromosome configuration. The optimal time of culture in presence of roscovitine to arrest meiosis of porcine oocyte was 17 h (p<0.05), although MII rates and normal morphology of the meiotic spindle and chromosomal alignment were not significantly different among various times of culture. In conclusion, the optimal concentration and time of culture in presence of roscovitine to arrest porcine oocytes are $50\;{\mu}M$ and 17 h, respectively.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제34권3호
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• pp.169-173
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• 2010

Correlations between cumulus cells and germinal vesicle (GV) chromatin configuration were examined in porcine oocytes. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from 2~6 mm follicles and divided into three categories according to cumulus cell morphology. "A" group was compacted COCs with more than three cumulus cell layers. "B" group was COCs with less cumulus cell layers than "A" group. "C" group was COCs with one or less layer of cumulus cells. Cumulus cells were removed 0.1% hyaluronidase, and denuded oocytes were stained with Hoechst 33342. GV chromatin configuration was classified into GV-Con and GV-Dis. GV-Con meant that a nucleus was surrounded by condensed chromatin in a ring. GV-Dis meant that filamentous chromatin clumps were distributed in nucleus. The proportion (80.2%) of GV-Con in "A" group was significantly higher than "B" (62.0%) or "C" (44.9%). The proportion (55.1%) of GV-Dis in "C" group was significantly higher than "A" (19.8%) or "B" (38.0%). The meiotic competence of COCs was examined after 44 h culture. The proportion (90.0%) of oocytes reaching to metaphase II (M-II) in "A" group was significantly higher than "B" (76.5%) or "C" (45.5%). In conclusion, oocytes with good quality cumulus cell layers are synchronized early GV stage, and early GV stage is important for meiotic competence in pigs.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.283-289
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• 2004

동결 과정 중 필수적인 단계중 하나인 냉각(cooling)과 냉각 후 배양시간이 생쥐 난자의 방추체의 형태와 염색체의 배열에 미치는 영향을 알아봄으로서 냉각 후 손상되었던 난자의 방추체와 염색체가 정상적으로 회복하는데 필요한 최적의 배양시간을 알아보기 위해 본 실험을 실시하였다. 생후 4-6주령의 암컷 B6C3Fl 생쥐를 과배란 처리하여 metaphase II상태의 난자를 회수하여 다음과 같이 처리하였다. 대조군은 난자를 냉각처리하지 않았으며 실험군은 난자를 $0^{\circ}C$에서 30분간 냉각한 후 37$^{\circ}C$에서 가온하여 즉시 일부 난자는 면역형광 염색을 실시하고 나머지 난자는 5% $CO_2$ 37$^{\circ}C$가 유지된 배양기내에서 Ml6 배지에 각각 5분, 15분, 30분, 60분, 120분간 배양한 후 면역 형광염색을 실시하였다. 난자의 방추체와 염색체를 평가하기 위한 면역형광염색은 Zenes 등의 방법(2001)에 준하여 실시하였다. 냉각처리하지 않은 생쥐 난자를 면역형광 염색하여 방추체와 염색체를 관찰한 결과 생쥐 metaphase II 상태의 난자는 대칭성의 원통모양의 방추체 형태를 보였으며 염색체는 metaphase plate위에 분리된 다발모양으로 밀집되어 보였다. 냉각 직후 미세관의 소실에 의한 방추체 형태의 이상과 형광성의 소실이 나타났으며 염색체는 다발모양의 밀집된 형상에서 벗어나 비정상적인 배열상을 보였다. 냉각 처리된 난자를 37$^{\circ}C$에서 가온하고 배양하였을 때 미세관의 재중합이 일어나 미세관의 형광성을 회복하기 시작하였고 방추체는 정상적인 배열상으로 회복되었다. 생쥐 난자를 냉각처리한 후 배양시간에 따른 방추체 미세관의 형광성(FIS), 염색체의 배열, 방추체의 형태를 비교하였다. 배양 5분에서 60분까지 FIS, 정상 염색체 배열을 보인 난자의 비율, 정상 방추체의 형태를 보인 난자의 비율이 점진적으로 증가하였으나 120분 배양에서는 감소하였다(P<0.05). 위의 세 가지 평가를 기준으로 하여 냉각 후 난자의 회복율을 관찰하였을 때 배양 60분에서 최상의 회복율을 나타냈다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제32권7호
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• pp.956-965
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• 2019

Objective: The main goal of this study was to provide a morphological indicator that could be used to select high-quality oocytes of appropriate meiotic and developmental capabilities in pig. The higher quality of immature oocytes, the higher success rates of in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). Thus, prior to the IVM culture, it is important to characterize oocytes morphologically and biochemically in order to assess their quality. Two of the largest indicators of oocyte quality are the presence of cumulus cells and status of chromatin. To investigate the effects of porcine oocyte chromatin configurations on the developmental capacity of blastocysts, we assessed oocyte chromatin status according to follicle size and measured the developmental potency of blastocysts. Methods: To sort by follicle size, we divided the oocytes into three groups (less than 1 mm, 1 to 3 mm, and more than 3 mm in diameter). To assess chromatin configuration, the oocytes were assessed for their stages (surrounded nucleolus [SN] germinal vesicle [GV], non-surrounded nucleolus [NSN] GV, GV breakdown, metaphase I [MI], pro-metaphase II [proMII], and metaphase II [MII]) at different maturation times (22, 44, and 66 h). To assess the development rate, oocytes of each follicle size were subjected to parthenogenetic activation for further development. Finally, GV oocytes were grouped by their chromatin configuration (SN, SN/NSN, and NSN) and their global transcriptional levels were measured. Results: SN GV oocytes were more suitable for IVF than NSN GV oocytes. Moreover, oocytes collected from the larger follicles had a greater distribution of SN GV oocytes and a higher developmental capacity during IVM, reaching MII more quickly and developing more often to blastocysts. Conclusion: Porcine oocytes with high-level meiotic and developmental capacity were identified by analyzing the relationship between follicle size and chromatin configuration. The porcine oocytes from large follicles had a significantly higher SN status in which the transcription level was low and could be better in the degree of meiotic progression and developmental capacity.

• 식물분류학회지
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• 제35권1호
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• pp.47-55
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• 2005

백두산 및 만주 일대에 생육하는 17과 26속 29종류 31개 집단의 관속식물에 대하여 어린 꽃봉오리를 채취하고 이를 고정하여 감수분열상을 관찰하여 이들 지역에 생육하는 관속식물의 세포분류학적 특징을 논의하고자 하였다. 백두산 지역에서 채집된 종류는 두메양귀비, 등대시호, 땃두릅나무, 가는다리장구채, 비로용담 등 28 집단에 속하는 26종류이었으며 두만강변에서 채집된 종류는 현삼, 과꽃, 신감채 등 3종류로 나타났다. 본 연구를 통하여 비단쑥은 2n=9II로, Cacalia komaroviana는 2n=30II로, 바위구절초는 2n=27II로, 그리고 좁은잎돌꽃은 2n=11II로 그 염색체의 수가 새롭게 보고되었으며, 개발나물과 현삼의 경우는 새로운 염색체의 수가 보고되었다. 기타 기존의 보고와 염색체 수가 일치하는 종류들 중 도깨비엉겅퀴, 나비나물, Allium strictum 그리고 짚신나물의 경우는 4배체로 나타났으며, 두메양귀비는 6배체로 나타났다. 아울러 오랑캐장구채, 털부처꽃 및 물매화의 경우 2배체로 나타났다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제18권2호
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• pp.117-125
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• 2014

Vitrification method is widely used in oocyte cryopreservation for IVF but the birth rates are lower than that of the fresh oocyte. One of the known main reasons is structural instability of meiotic spindle and chromosome systems of mature oocyte. To get the best way for keeping competence of matured oocytes, we studied the best conditions for vitrification focused on equilibration times. The mature oocytes were underwent vitrification with current popular method and analyzed the survival rates, microtubule stability and DNA integrity. The survival rates of recovered oocyte are almost same between groups and are more than 93%. The structural configuration of meiotic spindle was well kept in 10 min equilibration group and the stability rate was almost same with that of control. The chromosomal breakdown was observed in all experimental groups, but the chromosomal stability was higher in 10 min equilibration group than the other groups. The 10 min equilibration group showed best condition compared with the other groups. Based on these results, the equilibration time is one of the key factors in successful keeping for competence of mature oocyte. Although, more fine analysis about the effects of physical stress on oocyte during vitrification is needed to define the optimal condition, it is suggested that the optimal equilibration time to get competent oocyte in mouse is 10 min. Information acquired this study may provide insight into intracellular structural events occurring in human oocytes after vitrification and application for cryopreservation of human oocyte.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제11권6호
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• pp.2124-2128
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• 2010

본 연구에서는 MAPK 저해제인 U0126이 난자성숙과정에서 특히 감수분열, 미세소관 형성 그리고 액틴 필 라먼트 형성에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 MAPK 단백질은 12시간째에 인산화되기 시작하여, 24시간째에 대부분 인산화 되었고 metaphase II에 이르기 까지 유지되었다. 배포단계(GV)에 있는 난자를 U0126의 $20{\mu}M$ 농도로 처리하였을 때 MAPK의 인산화가 완전히 억제되었으나 배포의 파열 단계(GVBD)로의 성숙에는 진행하였으나, metaphase I까지는 발달하지 못하였다. 또한 MAPK 저해제로 인해 비정상적인 방추사의 형성을 초래하였다. 난자를 배포의 파열단계(GVBD) 이후에 U0126을 처리하였을 때 극체의 방출은 정상 이였으나 중기 판의 배열과 염색체의 분열은 비정상적 이였다. 결론적으로, 유사분열 활성화 효소단백질인 MAPK의 활성은 돼지 난자의 체외성숙과정에서 배포단계(GV)의 염색체의 배열과 감수분열의 완성에 중요한 조절 인자임을 이번 연구를 통해 알 수 있었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제33권1호
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• pp.1-11
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• 2018

Cellular cyclic adenosine-3' 5'-monophosphate (cAMP) modulator is known as meiotic inhibitor and can delays spontaneous maturation in IVM experiment. Among many cAMP modulators, the role of Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on IVM isn't known. The purpose of this study is to improve the maturation of oocytes derived from follicles ${\leq}3mm$ in diameter through PACAP as meiotic inhibitor during pre-in vitro maturation (pre-IVM). First, we checked PACAP and its receptors in cumulus cells and, to establish the optimal phase and concentration of PACAP for pre-IVM, we conducted chromatin configuration assessments. As a result, the rate of GV (Germinal Vesicle) according to duration of pre-IVM was significantly decreased 12 h and 18 h after IVM (87.1 and 84.1%, respectively) compared to 0 h (99.4%). When COC was cultured for 18 h, the GV rate in the $1{\mu}M$ of PACAP treatment group (82.1%) was significantly higher than any other PACAP treatment groups (60.5, 64.1, 74.4 and 69.9 %, respectively). So, we divided into four groups as follows; MF (the conventional IVM group, obtained from follicle from 3 to 6 mm in diameter), SF (the conventional IVM group, obtained from follicle ${\leq}3mm$ in diameter), Pre-SF(-)PACAP (IVM group including 18 h pre-IVM without $1{\mu}M$ of PACAP, obtained from follicle ${\leq}3mm$ in diameter) and Pre-SF(+)PACAP (IVM group including 18 h pre-IVM with $1{\mu}M$ of PACAP, obtained from follicle ${\leq}3mm$ in diameter). To examine the effect of PACAP during pre-IVM, we investigated analysis of nuclear maturation, intracellular glutathione (GSH) and reactive oxygen species (ROS) levels. In cumulus cells, PACAP receptors, ADCYAP1R1 and VIPR1 were detected but were not detected in oocytes. After IVM, the Pre-SF(+)PACAP had the highest Metaphase II rate (91.7%) among all groups (P<0.05). The GSH levels in the MF and Pre-SF(+)PACAP were significantly higher than in the other groups (P<0.05) and ROS levels was no significant difference among all groups. In conclusion, these results indicated that even though the oocytes were derived from SF, pre-IVM application of PACAP improved meiotic and cytoplasmic maturation by regulating intracellular oxidative stress.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권2호
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• pp.143-154
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• 2000

본 연구는 생식보조기법을 시행한 불임환자로부터 얻은 난자를 일반적인 수정법과 세포질내 정자직접주입법으로 수정을 유도한 다음 정상수정에 실패한 난자에 대한 미세소관과 염색체의 형태학적 차이를 laser scanning confocal microscope를 이용하여 비교분석하고자 실시하였다. 일반적 수정법 혹은 세포질내 정자직접주입법 실시 후 18시간째에 해부현미경 하에서 난자를 관찰하였을 때 전핵형성에 실패한 미수정란, 한 개의 전핵 또는 3개이상의 전핵의 형성이 관찰된 이상수정란으로 구분하여 연구를 실시하였다. 미세소관의 관찰을 위해서 (-tubulin antibody를 반응시킨 후 형광물질이 부착된 2차항체와 반응시킨 후 관찰하였으며 염색체의 관찰을 위해서는 propidium iodide로 염색한 다음 confocal microscope 하에서 관찰하였다. 연구결과 대부분의 난자는 수정과정중에 있었으나 일부의 난자에서는 특정단계에서 정지되어 있는 것이 관찰되었다. 즉, 감수분열 중기에서 정자의 침입이 이루어지지 않은 경우, 정자의 침입은 이루어졌으나 sperm aster 형성이 불완전한 경우, 웅성 및 자성전핵의 형성에 실패한 경우 및 전핵의 위치가 불완전한 경우 등이 관찰되었고 이들 난자의 경우 높은 비율로 미세소관과 염색체의 이상이 관찰되었다. 이상의 연구결과로 미루어 볼 때 생식보조기법의 시술과정에서 채취되는 난자의 수정실패의 원인은 세포골격기관 특히 미세소관의 이상과 염색체의 이상에 기인되는 것으로 사료되면 이러한 세포골격 구성물질의 이상에 대해서는 추후에 세포조직학적 또는 분자생물학적 분석이 필요하다고 하겠다.

• 대한수의학회지
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• 제34권4호
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• pp.735-744
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• 1994

미성숙 래트의 외경정맥에 카테타를 장착하고, 다음날(28일령) 대조군에는 4IU, 다배란처치군에는 20IU의 PMSG를 피하 주사하였다. 각 실험동물은 혈중의 LH농도 변화를 측정하기 위하여 PMSG 투여직전(0시간), 투여후 12시간, 그 이후 6시간 간격으로 혈액을 채취하고 72시간에 희생시켰다. 그 결과 다배란용량의 PMSG 투여는 먼저 배란반응을 대조군에 비하여 4.0배나 현저하게(P<0.05) 증가시켰다. 또한 난관으로부터 회수된 다배란난자는 상당히 다른 감수분열상의 핵성숙도를 나타내었는데, 즉 prophase I이 14.7%, anaphase I이 36.2%, telophase I이 10.3%, metaphase I/II가 32.4%이었다. 그러나 대조군의 래트에서는 대다수(94.0%)의 난자가 한결같이 metaphase II상을 보였다. 그리고 혈청 LH농도는 radioimmunoassay(RIA)에 의하여 결정되었는데, 먼저 두군 모두 두개의 분명한 peak을 가진 경시적 변화관계를 보였다. 즉 이들 두군에 있어서 LH농도변화는 0-18시간대에 처음으로 완만한 증가와 54-60시간대에 두번째의 급격한 증가(surge)를 보였다. 그러나 두군간에 LH농도의 크기는 현저하게 달라, 다배란처치군의 동물에 있어서는 두번째의 LH peak에 앞서 전반적인 LH농도가 대조군보다 현저하게(P<0.001) 높았으나, FMSG 투여후 60시간에 일어나는 peak에 있어서는 LH농도가 대조군보다 현저하게(P<0.001) 54%나 낮았다. 덧붙여 두 peak간의 증가폭은 대조군에 비하여 다배란처치군에서 훨씬 낮았다. 다배란래트에 있어서 54시간 이전에 최초로 연속적인 증가를 보인 고농도의 혈청 LH는 실제적으로 투여된 PMSG와 측정시의 LH항체와의 교차반응(cross-reaction)에 의한 결과로 판명되었고, 한편 54시간과 60시간에 있어서 두번째로 급격한 증가를 보인 혈청 LH는 주로 뇌하수체로부터 분비되는 내재성 LH surge에 의한 것으로 사료된다. 본 연구 결과는 PMSG투여된 래트에 있어서 혈청 LH의 경시적인 변화상 및 그 특징을 정의한다. 그리고 전체적인 연구결과는 첫째, 다배란용량의 PMSG투여에 따른 배란반응의 증가가 주로 PMSG 자체에 함유된 고나도트로핀 작용과 연관이 있고, 둘째, 미성숙 또는 부동기적 핵성숙을 보이는 다배란난자의 회수는 최초의 혈청 LH의 연속적인 증가 및 이의 연이은 감퇴로 특징지워지는 LH활동도의 비정상적 혈중변화에 기인함을 시사한다.