• 미생물학회지
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• 제50권4호
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• pp.327-333
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• 2014

산성 배지에서 성장하며 mannanase를 생산하는 균으로 분리된 Bacillus sp. YB-1401과 B. amyloliquefaciens YB-1402로부터 mannanase 유전자를 각각 클로닝하고 그 염기서열을 분석한 결과 2개 유전자는 동일하게 360 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,080 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 아미노산 잔기 배열의 유사성을 분석한 결과 이들 mannanases는 서로 4개의 잔기가 다르며 glycosyl hydrolase family 26에 속하는 mannanase와 상동성이 높았다. 재조합 대장균이 생산하는 YB-1402 유래의 His-tagged mannanase (HtMAN1402)가 YB-1401 유래의 His-tagged mannanase (HtMAN1401)에 비해 열안정성과 산성 pH에서 안정성이 높았다. 특히 HtMAN1402는 pH 3.0에서 4시간 방치 후에도 약 50% 이상의 잔존활성을 보여 사료첨가용 효소로 사용되기에 적합한 특성을 보였다. 또한 이들 효소는 $Ca^{2+}$ 이온에 의해 열안정성이 증가하는 것으로 확인되었다.

• 미생물학회지
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• 제51권3호
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• pp.263-270
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• 2015

탄소원으로 Avicel이 첨가된 배지에서 공주에 소재한 밤 나무 농장의 토양 미생물을 증균 배양하여 mannanase를 생산하는 미생물을 분리하였다. 분리균 YB-43의 16S rDNA 서열은 Cellulosimicrobium 속 균주와 유사도가 99.6% 이상으로 가장 높게 나타났다. Locust bean gum (LBG)이나 konjac이 첨가된 배지에서 분리균의 mannanase 생산성이 크게 증가하였다. 0.7% LBG가 첨가된 LB 배지에서 Cellulosimicrobium sp. YB-43이 균체외로 생산한 mannanase를 DEAE-Sepharose와 Q-Sepharose 컬럼 크로마토그래피로 부분 정제하여 mannanase A (ManA)와 mannanase C (ManC)로 분획하였다. ManA는 $55^{\circ}C$와 pH 6.5, ManC는 $65^{\circ}C$ pH 7.5에서 최대활성을 보였으며, ManA는 $40^{\circ}C$ 이하에서 1시간 동안 실활되지 않았으나 ManC는 $20^{\circ}C$에서도 상당량 실활되었다. 또한 ManA와 ManC는 기질특이성과 mannooligosaccharides의 최종 분해산물에도 차이가 있는 것으로 나타났다. 이로 보아 Cellulosimicrobium sp. YB-43은 특성이 서로 다른 2종류 mannanases를 생산하는 것으로 판단된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제7권
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• pp.1-13
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• 1966

(1) 콩과 식물인 guar (Cyamopsis tetragonolobus)의 발아종자(發芽種子)에서 세 가지의 다른 다당류가수분해효소(多糖類加水分解酵素)인 ${\beta}-1$, 4-mannanase A,B,C 를 추출(抽出), 유안염석(硫安鹽析), 이온교환(交換)크로마토그래휘 및 젤여과법(濾過法)에 의하여 분리(分離), 정제(精製)하였다. (2) 이들 효소(酵素)는 작용최적(作用最適) pH, 급속이온의 영향, 분자량(分子量), ior nut mannan A에 대한 Michaelis 항수(恒數), 가수분해(加水分解)의 한도(限度) 및 생성물등(生成物等) 여러 가지 점(點)에서 다르다. (3) ${\beta}-1$, 4-Mannanase A 와 C 는 기질(基質)인 ${\beta}-1$, 4-mannanase 에 random으로 작용(作用)하여 과당류(寡糖類)를 생성(生成)하는 endo형(型) 효소(酵素)임이 밝혀졌다. 한편 ${\beta}-1$, 4-mannanase B 는 같은 기질(基質)의 비환원말단기(非還元末端基)로 부터 수차로 작용(作用)하여 단당류(單糖類)를 생성(生成)하는 exo형(型) 효소(酵素)로 추리(推理)된다. (4) Guar 종자중(種子中)의 galactomannan 인 guaran에 이들 정제효소(精製酵素)를 작용(作用)시킨 결과(結果)로부터 기질(基質)의 구조(構造) 및 guar 종자(種子)의 발아중(發芽中)에 가지는 역할(役割)과 관련시켜 논의(論議)하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권10호
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• pp.1688-1694
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• 2007

A gene encoding the mannanase of Bacillus subtilis WL-3, which had been isolated from Korean soybean paste, was cloned into Escherichia coli and the nucleotide sequence of a 2.7-kb DNA fragment containing the mannanase gene was subsequently determined. The mannanase gene, designated manA, consisted of 1,080 nucleotides encoding a polypeptide of 360 amino acid residues. The deduced amino acid sequence was highly homologous to those of mannanases belonging to glycosyl hydrolase family 26. The manA gene was strongly expressed in B. subtilis 168 by cloning the gene downstream of a strong B. subtilis promoter of plasmid $pJ27{\Delta}88U$. In flask cultures, the production of mannanase by recombinant B. subtilis 168 reached maximum levels of 300 units/ml and 450 units/ml in LB medium and LB medium containing 0.3% locust bean gum, respectively. Based on the zymogram ofthe mannanase, it was found that the mannanase produced by recombinant B. subtilis could be maintained stably without proteolytic degradation during the culture time.

• 생명과학회지
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• 제26권10호
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• pp.1113-1120
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• 2016

우리나라의 전통 발효 된장으로부터 균체외 효소로 mannanase를 생산하는 세균 2주가 분리되었다. 분리균 WL-6과 WL-11은 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rDNA의 염기서열에 따라 Bacillus subtilis로 확인되었다. 이들 두 균주로부터 각각 mannanase 유전자를 대장균에 클로닝하여 염기서열을 결정한 결과 mannanase 유전자는 362 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,086 뉴클레오티드로 동일하게 이루어졌다. WL-6과 WL-11 mannanase (Man6, Man11)의 아미노산 잔기 배열은 서로 8개 잔기가 다르며 GH family 26에 속하는 B. subtilis의 mannanases와 매우 상동성이 높았다. Man6과 Man11의 아미노 말단의 26개 아미노 잔기가 signal peptide로 예측되었다. 재조합 대장균로부터 각각 생산된 Man6과 Man11은 94~95% 정도가 균체내에 존재하였고, mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, mannohexaose와 같은 만노올리고당과 locust bean gum을 유사하게 분해하여 주된 반응산물로 mannobiose와 mannotriose를 생성하였다. Man6는 55℃와 pH 6.0, Man11은 60℃와 pH 5.5에서 각각 최대 반응활성을 보였으며, Man11이 Man6에 비해 열안정성이 높았다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제14권6호
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• pp.1295-1302
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• 2004

A gene encoding the mannanase of Bacillus subtilis WL-7, which had been isolated from Korean soybean paste, was cloned into Escherichia coli, and the gene product was purified from the culture filtrate of the recombinant E. coli. This mannanase gene, designated manA, consisted of 1,086 nucleotides, encoding a polypeptide of 362 amino acid residues. The deduced amino acid sequence was highly homologous to those of mannanases belonging to the glycosyl hydrolase family 26. The molecular mass of the purified mannanase was 38 kDa as estimated by SDS-PAGE. The enzyme had a pH optimum at 6.0 and a temperature optimum at $55^{\circ}C$. The enzyme was active on locust bean gum, konjak, guar gum, and lichenan, while it did not exhibit activity towards yeast mannan, laminarin, carboxymethylcellulose, $\beta$­glucan, xylan, and para-nitrophenyl-$\beta$-mannopyranoside.

• 미생물학회지
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• 제46권2호
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• pp.207-212
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• 2010

전통 발효식품인 된장으로부터 mannanase의 생산균으로 분리된 WL-8 균주는 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rRNA의 염기서열에 근거하여 Bacillus subtilis로 동정되었다. B. subtilis WL-8은 locust bean gum 보다는 밀기울이 첨가된 LB 배지에서 mannanase 생산성이 높았으며, 24시간 배양하였을 때 약 20 U/ml에 이르렀다. 분리균 WL-8의 mannanase 유전자를 클로닝하여 그 염기서열을 결정한 결과 mannanase 유전자는 362 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,086 뉴클레오티드로 이루어졌다. 아미노산 잔기배열을 분석한 결과 WL-8의 mannanase는 GH family 26에 속하며 B. subtilis의 mannanases와 매우 상동성이 높았다. B. subtilis WL-8의 mannanase 유전자를 함유한 재조합 대장균의 배양상등액과 균체파쇄상등액을 사용하여 반응특성을 조사한 결과 pH 5.5와 $60^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였으며, $60^{\circ}C$보다 높은 온도에서 배양상등액보다는 균체파쇄상등액에 존재하는 mannanase가 더 높은 활성을 보였다.

• 미생물학회지
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• 제52권3호
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• pp.336-343
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• 2016

두 종류의 mannanases를 생산하는 Cellulosimicrobium sp. YB-43로부터 mannanase 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 결정하였다. Mannanase 유전자는 manB로 명명되었으며, 427 아미노 잔기로 구성된 단백질을 코드하는 1,284개 염기로 구성되었다. ManB는 추론된 아미노산 배열에 근거해서 glycosyl hydrolase family 5에 속하는 mannanase와 상동성이 높은 활성영역과 함께 2개의 탄수화물 결합영역을 포함하고 있는 다영역 효소로 확인되었다. Cellulosimicrobium sp. YB-43의 manB 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 정제된 ManB의 아미노 말단 배열이 QGASAASDG로 결정되었으며 이는 SignalP4.1 server로 그람 음성균을 기준으로 예측된 signal peptide의 결과와 정확하기 일치하였다. 정제된 ManB의 최적 반응조건은 $55^{\circ}C$와 pH 6.5-7.0이며 locust bean gum (LBG), konjac과 guar gum을 가수분해 하였으며, 셀룰로스, 자일란, 전분과 para-nitrophenyl-${\beta}$-mannopyranoside에 대해서는 분해활성이 없었다. ManB의 활성은 $Mg^{2+}$, $K^+$와 $Na^+$에 의해 약간 저해되었으며 $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Mn^{2+}$과 SDS에 의해서는 크게 저해되었다. 또한 이 효소는 mannobiose 보다 큰 중합도를 갖는 만노올리고당을 가수분해하였으며, LBG와 만노올리고당을 가수분해하였을 때 mannobiose가 가장 많은 양으로 생성되었다.

• 생명과학회지
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• 제27권9호
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• pp.1003-1010
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• 2017

Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 mannanase를 코드하는 것으로 유추되는 open reading frame을 중합효소연쇄반응으로 증폭하여 대장균에 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. Mannanase 유전자는 man26AT로 명명하였으며 1,053 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하는 3,159 뉴클레오티드로 이루어졌다. 아미노산 잔기배열을 분석한 결과 Man26AT는 glycosyl hydrolase family 26의 mannanase와 상동성이 높은 활성영역, 탄수화물 결합영역 CBM27과 CBM11로 구성되어 있었다. Man26AT의 아미노산 배열은 P. ihumii의 유추된 mannanase와 상동성이 81%이고 다른 Paenibacillus 속 균주의 여러 mannanases와 57% 이하의 상동성을 보였다. man26AT 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액은 $55^{\circ}C$와 pH 5.5에서 최대의 mannanase 활성을 보였고, $50^{\circ}C$에서 1시간 열처리한 후에 80% 이상의 잔존활성을 보였다. Man26AT는 locust bean gum (LBG) galactomannan과 konjac glucomannan에 대한 분해활성이 유사하였으며, carboxymethylcellulose, xylan과 para-nitrophenyl-${\beta}$-mannopyranoside는 분해하지 못하였다. Man26AT에 의해 mannotriose, mannotetraose, mannopentaose와 mannohexaose 등의 만노올리고당이나 LBG로부터 공통의 최종 가수분해 산물로 mannose, mannobiose와 mannotriose가 생성되었다. 또한 mannotriose 보다 큰 만노올리고당이 LBG와 guar gum의 분해산물로 각각 생성되었다. 그러나 Man26AT는 mannobiose를 분해하지는 못하였다. 활성염색을 통해 Man26AT는 균체 내에서 3개 이상의 크기가 다른 활성 단백질로 분해된 것이 확인되었다.

• 미생물학회지
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• 제54권2호
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• pp.126-135
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• 2018

여러 종류의 mannanase를 생산하는 Cellulosimicrobium sp. YB-43으로부터 mannanase B를 암호하는 manB 유전자와 효소의 특성이 보고된 바 있다. Mannanase C (ManC)로 명명한 효소의 유전자가 manB 유전자의 하류에 위치한 것으로 예상되어 이를 중합효소 연쇄반응으로 클로닝하여 manC 유전자의 염기서열을 결정하였다. ManC는 448 아미노산 잔기로 구성된 것으로 확인되었으며 glycosyl hydrolase family 5에 속하는 mannanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역(CBM2)이 존재하였다. ManC의 활성영역은 Streptomyces sp. SirexAA-E (55.8%; 4FK9_A) 및 S. thermoluteus (57.6%; BAM62868)의 mannanase와 아미노산 배열의 상동성이 55% 이상으로 가장 높았다. Signal peptide 영역이 제거되고 카르복실 말단에 hexahistidine이 연결되도록 제조한 His-tagged ManC (HtManC)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtManC를 정제하였다. HtManC은 $65^{\circ}C$와 pH 7.5에서 최대 활성을 보였으며 pH 7.5~10범위에서 활성에 큰 변화가 없었다. HtManC는 locust bean gum (LBG)과 konjac에 대한 분해 활성이 guar gum과 ivory nut mannan (ivory nut)에 비해 높았다. 최적 반응조건에서 LBG를 기질로 하여 반응 동력학적 계수를 측정한 결과 Vmax와 Km이 68 U/mg과 0.45 mg/ml로 나타났다. HtManC에 의한 만노올리고당(MOS)과 mannan의 분해산물을 TLC로 관찰한 결과 mannobiose 보다 중합도가 큰MOS로부터 mannobiose와 mannotriose가 주된 분해산물로 생성되었다. 또한 LBG, konjac과 ivory nut의 분해산물로 mannobiose와 소량이 mannose가 공통적으로 관찰되었다.