근류균과 대두의 공생에서 숙주 결합성을 조사하기 위하여 대두종자로 부터 분리한 lectin과 뿌리추출물과의 동일성 여부를 조사한 결과는 다음과 같다. 탈지 대두분으로 부터 분리한 lectin은 크로마토그라피와 전기영동상 단일물질로 분리되었고 백운 및 팔달로 부터 분리한 lectin은 표준 lectin의 항체와 항원-항체 반응을 나타내어 동일한 물질이었다. 종자lectin 및 뿌리추출물 및 뿌리분비물에 대한 화학주성은 RCR 3407, KCTC 2422에서 뿌리분비물에 대한 주성이 가장 높았고 종자 lectin과 뿌리추출물은 비슷한 화학주성을 나타내었다. 대두의 유근으로 부터 분리한 뿌리추출물은 표준 lectin의 항체와 침강선을 형성하여 대두 종자 lectin과 동일한 물질임을 알수 있었으며 뿌리 분비물과는 침강선을 형성치 않았다. 대두와 상호접종군을 형성하는 RCR3407, KCTC2422 및 LPN-101은 대두의 종자 lectin 및 뿌리추출물과 결합하였으나 완두의 lectin과는 결합하지 않았고 대두와 근류형성을 하지않는 LPN-100은 대두의 lectin과 결합하지 않았다.
본 연구는 한국산 겨우살이 lectin유전자 (A 및 B chain) 을 효모 (Saccharmyces cerevisiae) 에 형질 전환시키는 시스템을 사용한 것으로, 효모내 효과적인 lectin유전자 발현을 위하여 유전자 상에 Kozak translation initiation sequence를 PCR을 이용 삽입, 변형시켜 재 클로닝 하였다. 변형된 lectin A 및 B 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드는 S. cerevisiae INVSc (MATa, his3 $\Delta$l, leu2, trpl-289, ura3-52) 에 형질전환 되었다. 형질전환된 효모는 ABI 3700 system을 이용한 DNA 염기서열 분석을 통해 확인되었고 재조합 한국산겨우살이 lectin 발현을 위해 2% galactose를 사용하여 유도발현되었다. 재조합 lectin A 및 B 단백질은 SDS-PACE 및 western blotting 분석을 수행한 결과 약 29kDa 크기로 확인되었다. 재조합 lectin은 세포내 가용성 단백질 1mg중 1.24∼l.75 $\mu\textrm{g}$ 수준으로 발현되어짐을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 한편 lectin 유전자는 galartose 유도발현 후 36시간이 되 었을 때 발현량이 최대가 되었으며 lectin A 유전자의 경우 48 시간 이후에는 발현이 억제되었다.
렉틴투여 마우스의 소장을 고정절편으로 해서, HE 염색한 후 광학현미경관찰 및 조직을 반전고정해서 주사형전자현미경관찰을 하여, 소장점막의 미융모막의 변화를 대조군과 비교했다. 그 결과 소장융모의 팽윤, 단평화, 소장벽의 박약화, 상피세포의 밀도화 및 흐트러짐 등이 관찰되었다. 즉 렉틴이 정상적인 생체기능을 방해한다는 의미에서의 독활성이 있다는 것은, 소장조직에의 영양소흡수부전이 하나의 요인이 됨을 알 수 있다.
Recently, studies on missile antitumor drugs, which selectively act on tumor cell and display drug effects, have been performed. These missile antitumor drugs which can increase drug effects and decrease side effects, are ideal medication method. Lectin has been reported as tumor cell specific binding protein and tannin as antitumor substance. In this study, we studied inhibition of melanoma metastasis by lectin-conjugated ellagitannin and used praecoxin A as ellagitannin source. Mouse melanoma cell, B16-F10, was injected into the sole of forefoot of C57BL/6 mouse, and after administration with drug, the number of pulmonary tumor colony was counted. The administration of praecoxin A, lectin-praecoxin A mixiture, and lectin-conjugated praecoxin A was started after amputation of established tumor foci at right forefoot of mice and continued for 3 weeks with i.p. injection of one of those drugs A every 24 hours. Lectin-praecoxin A mixture, and lectin-conjugated praecoxin A significantly reduced the number of spontaneous pulmonary metastasis. Exposure to 5 mg/kg of lectin-praecoxin A mixiture and lectin-conjugated praecoxin A produced a statistically significant 38.3%, 41.8% reduction in the number of remaining pulmonary metastasis. These results suggest that metastasis inhibition by lectin-praecoxin A mixiture and lectin-conjugated praecoxin A are better than that of praecoxin A.
겨우살이 (Viscum atbum)는 민간요법에서 여러 질환에 치료제로 쓰이고 있다. 이는 겨우살이가 가지고 있는 lectin의 약리작용에 의한 것으로 그 가능성을 알아보고자 겨우살이 lectin의 항당뇨 효과를 연구하였다. 이를 위해 streptozotocin으로 당뇨를 유발시킨 흰쥐에 국내 참나무류에 기생하는 겨우살이의 추출물과 정제된 lectin을 경구와 복강내에 투여하여 조사하였다. 추출물을 29일 동안 경구 투여시 혈당치가 36%까지 현저히 감소하였으나, 정제된 lectin을 경구 투여시 항당뇨 효과가 현저히 나타나지 않았다 또한 정제된 lectin 0.4 mg/kg을 복강내에 주사시 당뇨군에서 2시간과 4시간에서 saline에 비 해 혈당치가 각각 32%와 28% 감소하였으므로 lectin의 항당뇨 효과는 뚜렷하였다.
강낭콩 유식물로부터 PBS에 의한 추출, $(NH_4)_2SO_4$ 침전, Sepadex G-100 column chromatography에 의해 lectin을 분리한 다음, 이들의 생화학적 특성으로서 분자량, 적혈구 응집반응, 열 안정성, 최적 온도 및 최적 pH를 연구하였다. 이 과정에 토끼 혈액의 적혈구를 이용하여 활성을 측정하였다. 이 lectin의 분자량은 46 kDa와 44 kDa로서, 각각 2개의 subunit를 갖는 tetramer이다. 정제된 이 lectin의 최적 반응 온도는 30$^{\circ}C$이며, $40\sim80^{\circ}C$에서 열 안정성을 보였다. 또한 이 lectin의 최적 pH는 pH 8.2이다.
A novel lectin specific to N-acetyl-D-galactosamine as well as N-acetyl-D-glucosamine was isolated from Bryopsis plumosa and named as BPL-4. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophorese (SDS-PAGE) and matrix-assisted laser desorption / ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry data showed that this lectin was a monomeric protein with molecular weight 12.9 kDa. The N-terminal amino acid sequences of the lectin were determined by Edman degradation and the full cDNA sequence encoding this lectin was obtained using the degenerate primers designed from the amino acid sequence. The size of the cDNA was 414 bp containing single open reading frame (ORF) encoding the lectin precursor. The homology analysis showed that this lectin might belong to H lectin group. BPL-4 showed high sequence similarity (60.6%) to BPL-3, which is a previously reported lectin from the same species. The comparative analysis on the lectin's primary structure showed two conserved domains including one possible active domain of H lectin group.
표고버섯(Lentinula edodes) 으로부터 0.15 M NaCl 용액에 의하여 crude lectin을 추출하였으며, 황산암모늄에 의한 침전 음이온교환수지 및 hydroxyapatite 컬럼을 이용한 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 버섯균산과 균병으로 나누어 추출된 crude lectin의 양에 있어서는 균산부분이 균병부분에 비하여 2배 이상 높은 lectin을 함유하였으며, 가열한 버섯에서는 lectin의 함량 및 활성은 미처리보다 감소되었다. 건조된 균산 50 g으로부터 얻은 crude lectin은 720 mg으로서 46.03%의 수율로 얻었으며, DEAE Sephadex A-50 column에 의한 분리, 정제 후 정제된 lectin 201 mg을 crude lectin의 28% 수율로 얻을 수 있었다. Crude lectin을 정제함으로서 aspartic acid, serine, alanine 및 histidine등의 아미노산이 증가되었고, glutamic acid, glycine, leucine, tyrosine 및 methionine 등이 lectin에는 검색되지 않았다. DEAE Sephadex A-50 column의 chromatograpy를 통해 분리 정제한 활성을 지니는 lectin의 주된 부분은 Agglutinating test 결과, fraction A 및 B는 적혈구응집활성을 나타냈으며, 약 23 kDa의 분자량을 가지고 있었다. 활성을 지니는 부분을 다시 hydroxyapatite column에 의해 정제하여 얻은 LA-a와 LB-b는 각각 24 kDa과 23 kDa의 분자량을 나타냈다.
Lectin is a cell-agglutinating and carbohydrate-binding protein present in many plants. The lectin of Canavalia ensiformis shoot with specific affinity for D-glucose was purified by affinity chromatography using Sephadex G-100, and some of its biochemical characterizations were studied. Lectin was purified 8.87-fold and exhibited final specific activity of 225.74 units/mg protein with a $2.3\%$ yield. SDS-PAGE analysis demonstrated that the purified shoot lectin exists as a tetramer of 102 kD, composed of two subunits with molecular weight of 29 and 22 kD. The purified lectin was observed to agglutinate rabbit blood cell. The optimal temperature for the activity of this lectin was $40^{\circ}C$, and this lectin was relatively stable to heat with the highest activity at $50{\~}60^{\circ}C$. The maximal activity was observed at pH 7.2.
Generally, antitumor drugs have strong toxicity and result in damage in normal cells. Previously, lectin has been reported as a tumor cell specific binding protein and tannin as an antitumor substance. In this study, we investigated antitumor activity of lectin-conjugated ellagitannin and used praecoxin A as an ellagitannin source. We injected mouse melanoma cell, B16-F10, on right the femoral region of C57BL/6 mouse. After 10 hours later, first treatment with praecoxin A, lectin-praecoxin A mixiture and lectin-conjugated praecoxin A was carried and followed by injection i.m. every 48 hours. Praecoxin A extended the life of mice up to 14.8% in comparison with the negative control group at 5 mg/kg dose. The life extending ratio of Lectin-praecoxin A mixture was 26.1% at 5 mg/kg dose, and the life extending ratio of lectin-conjugated praecoxin A was 28.7% at 5 mg/kg dose. On the basis of these findings, we suggest that antitumor activities of lectin-praecoxin A mixiture and lectin-conjugated praecoxin A on survival are better than that of praecoxin A.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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