토양에서 분리, 동정한 Steptomyces sp. GI 32의 glucose isomerase 생산은 sorbitol 1%, yeast extract 0.4%, tryptore 0.6%, 1 mM Fe$_2$(SO$_4$)$_3$의 조성을 가진 배지에서 초기 pH 7.0으로 조절하여 35$^{\circ}C$에서 약 18시간 진탕배양시 효소생산량이 최고로 240 units/mg이었다. 효소는 ammonium sulfate 분획, DEAE cellulose chromatography 등의 과정을 거쳐 부분정제한 결과 3배정도 효소 비활성이 증가하였다. 효소활성의 치적온도는 7$0^{\circ}C$이며, 최적 pH는 8.0이었다. 특히 효소의 열안정성이 7$0^{\circ}C$에서 1시간 가열하여도 전혀 실활되지 않았다.
Many secreted proteins have disulfide bonds that are important for their structure and function. Protein disulfide isomerase (PDI, EC 5.3.1.4.), an enzyme that catalyzes the formation and rearrangement of thiol/disulfide exchange reactions, is a resident of the endoplasmic reticulum (ER). The subcellular localization and its function as catalyst of disulfide bond formation in the biosynthesis of secretory and cell membrane proteins suggest that PDI plays a key role in the secretory pathway. We have isolated a cDNA encoding protein disulfide isomerase from Bombyx mori(bPDI). It has been characterized under ER stress conditions (dominantly induced by calcium ionophore A23187, tunicamycin and DTT), which is known to cause an accumulation of unfolded proteins in the ER. Furthermore, It has also been examined for tissue distribution(pronounced at the fat body), hormonal regulation (juvenile hormone, insulin and juvenile +transferrin; however, it is not effected by transferrin alone), and the effect of exogenous bacteria (peak at 16 h after infection) on the bPDI mRNA expression. The results suggest that bPDI is a member of the ER stress protein group, and it may play an important role in exogenous bacterial infection in fat body, and that homones regulate its expression.
소나무 숲 토양에서 방선균을 666주 선별한 후 이중 glucose isomerase 생산성이 우수하고 (488U/ml) 40 포도당액의 이성화율이 5%3에 도달하는 TH34 균주를 선별하였다. 이 균주는 세포벽을 구성하는 diaminopimelic acid(DAP), 기균사의 색깔, spiral type의 spore 사슬의 형태, melanoid 색소형성, 탄수화물 이용성 및 전자현미경 사진등으로 미루어 보아 Streptomyces luteogriseus로 동정하였다. 분리 동정한 S.luteogriseus의 발효조건 및 배지조성 등을 검토하여 본 결과 28~$29^{\circ}C$에서 효소생산이 최대이었으며 pH 6.0~8.0의 넓은 범위에서 안정한 효소생산을 보였다.
The whole cells of Actinoplanes missouriensis KCTC 1780 which produce glucose isomerase was immobillized by flocculation method for the effective production of high fructose syrup using packed-bed bioreactor system. Among the flocculation methods used In this study, the glucose Isomerase activity of flocculated cells using 5% polyethylenimmine and 0.2% glutaraldehyde was the highest as 46.3 unit, and the flocculant was 10.3g(wet weight) per 100m1 of broth, and the residual activity was 92.5%. In the batch operation of glucose isomerization using the flocculated cells, the optimum pH, temperature and isomerization ratio were 7.0, 75$^{\circ}C$ and 31%, respectively. The optimum concentration of Mg2+ which was activator on the glucose isomerization of flocculated cells was 0.1M, and glucose isomerase activity was increased by about 40% compared to none of Mg2+. In the packed-bed bioreactor system with 1.2 hour of residence time at 7$0^{\circ}C$, the reaction stability maintained until 96 hour without toss of activity, and the equilibrium was kept up to 120 hours of the operation.
Xylose (glucose) isomerase was purified to homogeneity from cell-extracts of Streptomyces chibaensis J-59 via ammonium sulfate precipitation followed by chromatography on DEAE-cellulose, and gel filtration on Sephacryl S-300. The purified enzyme is a homotetramer with a native molecular mass of 180 kDa and a subunit molecular mass of 44 kDa. The amino acid N-terminal sequence of glucose isomerase from S. chibaensis J-59 was determined to be Ser-Tyr-Gln-Pro-Thr-Pro-Glu-Asp-Arg-Phe-Thr-Phe-Gly-Leu. The first 14 amino acids of the N-terminal sequence of the enzyme showed strong analogies with N-terminal sequences of glucose isomerase produced by other Streptomyces spp. The optimum pH and temperature for activity were 7.5 and 85, respectively. The purified enzyme required $Mg^{2+}$, $Co^{2+}$, and $Mn^{2+}$ for the activity, $Mg^{2+}$ being the most effective. The enzyme was not inhibited by $Ca^{2+}$, but was inhibited by $Hg^{2+}$, $Ag^+$, and $Cu^{2+}$. The $K_m$, $V_{max}$, and $k_{cat}$ values of S. chibaensis J-59 isomerase for glucose were 83 mM, 40.9 U/mg, and $1,843min^{-1}$, respectively. In the presence of $Co^{2+}$, cell-free enzymes retained 100% without loss of activities by the heat-treatment at $70^{\circ}C$ for 7 days. The enzyme retained 50% residual activity after heating at $85^{\circ}C$ for 13.5 h, at $90^{\circ}C$ for 126 min. The enzyme is more thermostable than any other glucose isomerases of Streptomyces spp.
포도당 이성화효소를 coding는 Bacillus licheniformis ATCC31667의 유전자를 Escherichia coli LE 392-6에 클로닝하였다. Bacillus lieheniformis 염색체 DNA를 분리하고 제한효소인 Pst I.HindIII, Sal 1, EcoR 1, BamH1으로 절단한 후 운반제 plasmid인 pBR332에 연결하고 포도당 이성화효소 negative인 E. coli LE 3926-6에 형질전환하였다. 이중 E채꺄 제한효소를 사용한 것만이 glucose isomerase positive로 전환되어 xylose를 유일 탄소원으로 하여 성장하였다. 이 제조합 plasmid를 제한효소로 처리하여 본 결과 4.1Kb의 Bacillus licheniformisdb전자가 옮겨 졌음을 확인했고 여기에 제한효소 HindII와 Puv II의 절단위치가 확인되어 제한요소 지도를 작정하였다. 이 재조합 plasmid pBGI6는 연속계대 10일 후에도 매우안정하게 유지되었다. 한편 포도당 이정화 효소의 안정을 측정하여 본 바 야생숙주에 비해 약 20배의 증가를 나타냈다.
호열성 진정세균인 Thermotoga maritima의 xylose isomerase 유전자를 대장균을 이용하여 클로닝하고 재조합 발현시켰다. 재조합 효소의 최적활성은 $90^{\circ}C$와 pH 8.0에서 관찰되었다. 사포닌을 재조합효소로 처리한 후 사람의 위암 세포주 (AGS)와 대장암 세포주 (HT-29)에 처리한 결과, 효소 무처리 사포닌에 비해 우수한 암세포 생육저해 활성을 나타냈다. 한편, 푸코이단을 재조합효소로 처리한 후 동일 세포주들에 처리한 결과, 효소 무처리 푸코이단과 비슷한 암세포 생육저해 활성을 보였다. 1 ${\mu}g/ml$ 농도의 효소 처리 사포닌은 100 ${\mu}g/ml$ 농도의 효소 무처리 사포닌과 유사하거나 우수한 암세포 생육저해 활성을 보였다. 본 연구결과는 기능성 식품이나 의약품의 개발에 참고가 될 것으로 사료된다.
Streptomyces sp. strain K-17의 포도당 이성화효소의 강력한 분비를 위해서는 inducer로서 D-xylose를 필요로 하고 있다. 그런데 D-xylose를 가하지 않고 1.0% glucose를 가한 배지에서 배양한 이성화효소 역가가 낮은 균체를 모아서 이것을 다시 0.05M인 산 완충액 (PH7.0)에 현탁시켜 0.5 % xylose를 가하여 호기적으로 해주었을 때 효소의 induction pattern을 조사한 결과 효소활성이 10시간까지는 처리 시간에 따라 직선상으로 증가하고 이에 비례해서 D-xylose의 양이 감소했으나 cell mass에 있어서는 거의 변동이 없었다. 이때 효소단백의 합성이 일어나고 있지만, 전 RNA함량에 있어서는 오히려 감소하였다. 이와 같이 질소원을 가하지 않는 non-growth phase에서도 효소단백의 합성이 일어나는 것은 세포내에 축적되어 있는 단백질의 turn-over에 의한다는 것을 starvation 실험에서 알 수 있었다. D-xylose 이외에 D-ribose, L-arabinose, D-glucose, D-mannose, citrate, succinate 및 tartrate는 inducer로서의 효과가 없었다. 효소의 induction시, D-glucose를 가했을 경우catabolite repression 이 일어났으며 succinate 나 citrate 에 의해서도 강하게 효소생성이 억제되었다. 이와 같은 현상은 growth phase에서도 마찬가지 결과를 나타내었다. Induction시, $Ba^{2+}$, $Mg^{2+}$ 및 $Co^{2+}$가 효소생성을 발전시켰으며, C $u^{2+}$, C$d^{2+}$, A $g^{+}$ 및 H $g^{2+}$ 와 같은 중금속이 효소생성을 저해하였고, mitomycin C 몇 penicillin G는 효소생성에 영향을 주지 못하였으나, actinomycin D, streptomycin, chlora-mphenicol 및 tetra cycline등에 의해 강하게 저해되었다. 또 p-CMB 및 uncoupler 인 arsenate와 2.4-DNP에 의해서도 효소생성이 저해되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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