• 한국가축번식학회지
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• 제16권4호
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• pp.289-299
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• 1993

돼지 난포내의 각 구성분들에 대해 10% SDS-PAGE와 IEF를 이용한 이차원 전기영동을 실시하여 세포 및 난포액 구성분의 구조단백질상을 분석하였다. 난자-난구세포 복합체를 호르몬과 15%의 FCS가 포함된 M16 배양액으로 39$^{\circ}C$, 5% CO2 상태에서 35시간 동안 체외배양하였다. 배양 전후의 난자, 투명대 및 난구세포와 난포 크기별로 회수된 난포액들을 각각 분리 회수하여 구조단백질상을 분석하였으며, Silver 염색과 CBB 염색으로 분석이 가능한 각 구성분의 적정 시료량을 조사하였다. 한편 난포 구성분들에 있어서 난자는 분자량이 25와 114kd, 난구세포는 20, 33, 58, 78 및 112kd, 투명대는 65kd, 그리고 난포액은 18, 76, 92, 152 및 187kd 단백질을 세포특이단백질로 가지고 있음이 확인되었다. 특히 난자의 경우 성숙에 따라 구조단백질상의 변화가 확인된 반면, 난구세포에서는 차이가 없었다. 또한 난포액은 난포의 크기에 따라서는 단백질상의 차이가 없었으나 호르몬 처리 여부에 따라서는 이차원 전기영동상에서 몇가지 단백질에서 차이가 확인되었고, 난포세포들도 폐쇄 여부에 따라 단백질 조성에 차이를 보였다. 따라서 본 실험에서는 전기영동에 필요한 시료의 양과 준비 방법을 확립하여 각 난포 구성분들의 단백질상 분석에 대한 기초자료를 확립하였으며, 이상의 결과는 앞으로 진행될 단백질의 생합성 분석이나 면역화학학적 분석에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

• 미생물학회지
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• 제36권3호
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• pp.221-227
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• 2000

본 연구는 등전점과 PCR 생성물을 통하여 광범위 $\beta$-Lactamase(ESBL) 를 생성하는 Klebsiella pneumoniae의 ESBL 유형을 결정하였다. 부산시내 소재 3개 종합병원의 임상검체로부터 20균주의 ESBL 을생성하는 Klebsiella pneumoniae를 분리하였다. 제 3세대 cephalosporin인 cefotaime, cef-tazidime, ceftriaxone으로 double disk synergy test를 시행하여 ESBL 생성균주를 확인하였다. 등전점 및 PCR결과 TEM 형 (pI 5.2~6.0, 1080 bp), TEM+SHV 혼합형(pI 5.2~6.0 및 pI 7.0~7.4 로 1080 bp, 599bp), SHV형 (pI 7.0~ 7.4, 599 bp) , 그리고 PCR결과는 SHV형으로 나타났으나 등전점을 나타내지 않는 것과 등전점 및 PCR 결과 어느 쪽에도 속하지 않는 non TEM non SHV 형 등 5개군으로 나뉘어 졌다.

• 미생물학회지
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• 제43권2호
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• pp.116-123
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• 2007

본 연구는 부산지역 하천에서 plasmid 매개성 광범위 ${\beta}-lactam$ 분해효소(extended spectrum ${\beta}-lactamase;\;ESBL$)를 생성하는 세균을 분리하여 생성된 광범위 ${\beta}-lactam$ 분해효소를 유형별로 분류하기 위함이다. Escherichia coli 6균주와 Klebsiella pneumoniae 15균주가 피전달균주인 Escherichia coli J53 $Azid^{R}$에 plasmid 매개성 광범위 ${\beta}-lactam$ 분해효소 생성 인자를 전달하였다. PCR 후 얻은 유전인자를 plasmid로 매개된 광범위 ${\beta}-lactam$ 분해효소 유전자의 염기서열 분석결과, E. coli와 K. pneumoniae 유전자를 BCM Search Launcher 및 GenBank nucleotide database를 통하여 검색한 결과 ESBL 유형은 TEM-52형과 SHV-12형이었다. TEM-52는 E. coli와 K. pneumoniae 양쪽에서 분리되었다. 그러나 SHV-12는 K. pneumoniae에서만 분리되었다. 이상의 결과로부터 plasmid 매개성 광범위 ${\beta}-lactam$ 분해효소를 생성하는 세균이 한국에서는 이미 임상범위를 넘어 자연계까지 확산되었음을 알 수 있었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제42권1호
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• pp.39-44
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• 1999

각각 다른 성장기의 한우 등심에서 추출한 단백질을 이차원 전기영동법으로 분리하여 젤 상의 단백질 전개 양상을 비교하였다. 성장 0, 6, 12, 24 개월령의 한우 등심 단백질들을 길이 16 cm 튜브젤에서 등전점에 따라 분리하고, 이차원적으로 $18{\times}20$ cm, 12% SDS-polyacrylamide gel 전기영동 하여 단백질을 분리하였다. 등전점 3.0에서 9.0 그리고 분자량 15,000에서 100,000 Da 사이의 단백질들이 분리되어 Silver 염색법으로 명확히 구분할 수 있었다. 흥미롭게, 성장과정에서 단백질 발현이 증가했거나 감소한 단백질들은 저분자 단백질들 이었다. 성장 과정 중 증가된 단백질들을 분리하기 위해 수용성 단백질들을 조직으로부터 1% Triton X-100 으로 추출하였다. 그리고 이를 30%와 50% 황산암모니아로 분획하였다. 이와 같이하여 각 단백질들의 분리조건을 결정하였다. 이들 조건을 이용하여 발현이 증가된 단백질들을 분리하고 PVDF membrane에 옮겨서 아미노산 서열을 결정하여 단백질을 규명하였다.

• 한국수산과학회지
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• 제31권3호
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• pp.386-392
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• 1998

액젓의 객관적인 품질평가 기준을 설정하기 위하여, 전통적인 방법에 따라 발효 숙성시킨 멸치 액젓과 시판 멸치 액젓의 일반성분, 총질소량, 아미노산 함량, SDS-PAG전기영동을 통한 특정 펩티드의 면적을 측정하였고, 아울러 액젓 원료어의 판정을 위해 등전점 전기영동을 시도하였다. 멸치 액젓의 수분 함량은 대조구가 가장 낮은 $60.5\%$였으며, 시판 제품은 $65.5\%\~69.2\%$로 큰 차이가 없었으나, 총질소 함량은 시판 제품간에 비교적 큰 차이를 보이고 있었다. 액젓에 잔존하는 단백질의 함량은 Y사의 제품이 비교적 높은 $0.353mg/m{\ell}$ 였으며, 나머지 시판 제품은 $0.093mg/m{\ell}\~0.293mg/m{\ell}$의 범위였다 한편 SDS-PAG 전기영동상에서는 J사를 제외한 모든 액젓 제품에서 분자량 55,600 및 46,900 dalton의 band가 검출되었으며, 전기영동상에 나타난 단백질 band는 제조회사에 관계없이 거의 비슷한 형태를 나타내고 있었다. 그리고 등전점 전기영동에서 멸치 액젓은 등전점 5.6에 해당하는 펩티드가 공통적으로 존재하며, 특징적인 band임을 확인하였다. 따라서 아미노산 및 저분자 질소 화합물의 첨가 여부가 정량적인 값에 영향을 미치지 않는 전기영동 상의 특정 band의 면적비를 측정함으로서 인위적인 질소화합물의 첨가, 액젓 희석 여부 판정이 가능 할 것으로 판단되었다. 그리고 전 질소 함량, 아미노산 함량 및 SDS-PAG 전기영동 상에 있는 특징적인 55,600 dalton에 해당하는 펩티드 면적비의 상관관계는 멸치 액젓의 품질판정을 위한 기준으로 활용 가능함을 제시하고 있다.

• BMB Reports
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• 제39권2호
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• pp.216-222
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• 2006

In the present study, we compared six different solubilization buffers and optimized two-dimensional electrophoresis (2-DE) conditions for human lymph node proteins. In addition, we developed a simple protocol for 2-D gel storage. Efficient solubilization was obtained with lysis buffers containing (a) 8M urea, 4% CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate), 40 mM Tris base, 65 mM DTT(dithiothreitol) and 0.2% carrier ampholytes; (b) 5M urea, 2M thiourea, 2% CHAPS, 2% SB 3-10 (N-decyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate), 40mM Tris base, 65 mM DTT and 0.2% carrier ampholytes or (c) 7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 65 mM DTT and 0.2% carrier ampholytes. The optimal protocol for isoelectric focusing (IEF) was accumulated voltage of 16,500 Vh and 0.6% DTT in the rehydration solution. In the experiments conducted for the sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), best results were obtained with a doubled concentration (50 mM Tris, 384 mM glycine, 0.2% SDS) of the SDS electrophoresis buffer in the cathodic reservoir as compared to the concentration in the anodic reservoir (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS). Among the five protocols tested for gel storing, success was attained when the gels were stored in plastic bags with 50% glycerol. This is the first report describing the successful solubilization and 2D-electrophoresis of proteins from human lymph node tissue and a 2-D gel storage protocol for easy gel handling before mass spectrometry (MS) analysis.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제13권6호
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• pp.926-936
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• 2003

Overexpression of human Bcl-2 protein in recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cells producing humanized antibody (SH2-0.32) considerably suppressed sodium butyrate (NaBu)-induced apoptosis during batch culture by using commercially available serum-free medium, which extended the culture longevity. Due to the extended culture longevity provided by the anti-apoptotic effect of Bcl-2 overexpression, the final antibody concentration of 14C6-bcl-2 culture (Bcl-2 high producer, $23\;\mu\textrm{g}\;ml^{-1}$) was 2 times higher than that of the $SH2-0.32-{\Delta}bcl-2$ culture (cells transfected with bcl-2-deficient plasmid, $10.5\;\mu\textrm{g}\;ml^{-1}$) in the presence of NaBu. To determine the effect of NaBu/Bcl-2 overexpression on the molecular integrity of protein products, antibodies purified from 14C6-bcl-2 and $SH2-0.32-{\Delta}bcl-2$ cultures in the presence of NaBu were characterized by using various molecular assay systems. For comparison, antibody purified from the parental rCHO cell culture (SH2-0.32) in the absence of NaBu was also characterized. No significant changes in molecular weight of antibodies could be observed by SDS-PAGE. From GlycoSep-N column analysis, it was found that the core oligosaccharide structure ($GlcNAc_2Man_3GlcNAc_2$) was not affected by NaBu/Bcl-2 overexpression, while the microheterogeneity of N-linked oligosaccharide structure was slightly affected. Compared with the antibody produced in the absence of NaBu, the proportion of neutral oligosaccharides was increased from 10% (14C6-bcl-2) to 16% ($SH2-0.32-{\Delta}bcl-2$) in the presence of NaBu, which was accompanied by the reduced proportion of acidic oligosaccharides, especially of monosialylated and disialylated forms. The changes in microheterogeneous oligoformal structures of antibody in turn affected the mobility of antibody isoforms in isoelectric focusing (IEF), resulting in the occurrence of some more basic antibody isoforms produced in the presence of NaBu. However, the antigen-antibody binding properties were not changed by alteration of glycosylation pattern. The competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed that the antibody produced by NaBu/Bcl-2 overexpression maintained its antigen-antibody binding properties with binding affinity of about $2.5{\times}10^9{\;}M^{-1}$. Taken together, no significant effects of NaBu/Bcl-2 overexpression on the molecular integrity of antibodies, produced by using serum-free medium, could be observed by the molecular assay systems.

• 미생물학회지
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• 제37권4호
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• pp.277-283
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• 2001

본 논문은 임상검체 이외의 자연계내에서 extended-spectrum $\beta$-lactamase (ESBL) 생성균주의 분리 여부를 확인하고, 분리되었을 경우 이들의 유형을 조사하기 위함이었다. 하수종말처리장, 가물치양식장, 부경대학교 담수어양식장, 공중목욕탕으로부터 분리된 균주를 double disk synergy 검사, 교환접합시험, 등전점 조사 등을 실시하여 하수종말처리장 방류수로붙 extended-spectrum $\beta$-lactamase (ESBL) 생성균주가 26 균주 분리되었다. 균종은 Entero-bacter cloacae와 E. sakazakii, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae 및 K. pneumoniae subsp. ozaenae 였다. 이들은 모두 PCR결과 TEM+SHV 복합형이었고 등전점 결과 Klebsiella속의 균들은 pI 5.9, 5.9+5.4 E. cloacae는 $pI{\ge}8.5$, 8.0+5.4, E. sakazakii는 8.0+5.4, 8.0+5.9+5.4였다. 교차접합시험(transconjugation) 결과 피전달 균주인 E. coli RG176 nal$_{r}$에게 K. pneumoniae subsp. pneumoniae (1 균주) K. pneumoniae subsp. ozaenea (5 균주)및 E. cloacae (1 균주)의 $\beta$-lactamase 생성유전자가 전달되었다. 이 결과는 국내에서 임상검체 이외의 자연계에서 분리된 ESBL생성 장내세균의 첫 번째 보고이다.

• 대한수의학회지
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• 제40권2호
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• pp.283-290
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• 2000

The present study was carried out to investigate the blood markers of Cheju horses. The blood protein types (biochemical polymorphism) were tested from 73 Cheju native horses (CNH) and 118 Cheju racehorses(CRH) by horizontal polyacrylamide gel electrophoresis (HPAGE), isoelectric focusing (IEF) and starch gel electrophoresis (SGE). At the same time, their phenotypes and gene frequencies were studied. The biochemical polymorphism phenotypes observed with high frequency were A1B-KK(97.3%), ALB-AB(49.3%), AP-SS(100%), ES-II(30.1%), GC-FF(87.7%), HB-BIBI(49.3%), TF-F2R(41.1%), TF-EF2(8.2%), PGD-FF(97.3%), PGM-SS(50.7%), GPI-II(74.0%) in CNH, While A1B-KK(99.2%), ALB-BB(50.8%), AP-SS(99.2%), ES-II(42.4%), ES-IS(14.4%), GC-FF(95.8%), HBB-IB II(39.8%), TF-F2R(21.2%), PGD-FF(77.1%), PGD-SS(4.3%), PGM-SS(72.9%), GPI-II(90.7%) in CRH. Alleles observed with high frequency were $AlB^{K}$(0.986), $ALB^{B}$(0.616), $AP^{S}$(1.000), $ES^{I}$(0.479), $ES^{F}$(0.274), $GC^{F}$(0.938), $GPI^{I}$(0.856), $HB^{BI}$(0.685), $PGD^{F}$(0.993), $PGM^{S}$(0.753), $TF^{F2}$(0.404), $TF^{R}$(0.397) in CNH and $AlB^{K}$(0.996), $ALB^{B}$(0.720), $AP^{S}$(0.996), $ES^{I}$(0.661), $ES^{F}$(0.203), $GC^{F}$(0.979), $GPI^{I}$(0.936), $HB^{BI}$(0.534), $PGD^{F}$(0.864), $PGM^{S}$(0.852), $TF^{F2}$(0.428), $TF^{R}$(0.272) in CRH. $TF^{E}$(0.041) allele and silent gene($ES^{I{^*}}$ : 0.014) were observed in CNH. The mean heterozygosity in CNH and CRH was observed 0.2974 and 0.2864, respectively.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제34권4호
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• pp.342-351
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• 2006

병원내 항생제 다제 내성을 일으키는 CTX-M형 ESBL을 생성하는 E. coli와 Klebsielia pneumoniae의 생성현황을 조사하고 이들 균주로 인한 감염증치료와 역학적 조사연구에 도움이 되고자 효소의 유전형을 규명하였다. 2005년 7월-12월에 부산에 소재하고 있는 2개의 종합병원에서 분리된 E. coli와 K. pneumoniae 각각 153주, 52주를 수집하였다. 그 중에서 ESBL을 생성 하는 균주를 검출하기 위해 Double disk synergy test를 시행하여서 E. coli 23주와 K. pneumoniae 13주를 분리하였다. 균주의 동정은 Vitek system GNI card(bioMerieux Vitek Inc., Hazelwood, Mo., U.S.A.)로 확인하였고, 항생제감수성시험은 disk diffusion method 와 agar dilution method를 사용하였다. 분리된 균주들의 내성을 일으키는 ESBL유전형을 규명하기 위하여 Isoelectric focusing(IEF), polymerase chain reaction test, DNA sequencing을 시행하였다. A병원의 13주와 B병원의 10주로 총 23주의 E. coli(15.0%)와 A병원의 7주와 B병원의 6주로 K. pneumoniae 13주(25.0%)가 double disk synergy test 양성으로 ESBL 생성균주로 판정하였다. ESBL 생성 36균주를 대상으로 bla$_{TEM}$, bla$_{SHV}$, bla$_{CTX-M}$ 유전자 검출을 위한 PCR을 시행한 결과 bla$_{TEM}$ 유전자는 13주(36.1%), bla$_{SHV}$ 유전자는 13주(36.1%), bla$_{CTX-M}$ 유전자는 32주(88.9%)가 양성반응을 보여서 bla$_{CTX-M}$ 유전자를 가진 균주가 가장 많이 나타났다. 그리고, bla$_{TME}$, bla$_{SHV}$ 두 가지 유전자를 가지고 있는 균주는 1주(2.8%)만 나타났고 bla$_{TEM}$, bla$_{CTX-M}$두 가지 유전자를 가지고 있는 균주는 9주(25.0%), bla$_{SHV}$, bla$_{CTX-M}$ 두 가지 유전자를 가지고 있는 균주가 10주(27.8%)로 나타나 bla$_{CTX-M}$을 포함하는 복합유전자가 많이 증가함을 알 수 있었다. 또한 CTX-M형 ESBL을 생성하는 E. coli와 K. pneumoniae에 대한 cefutaxime의 MIC는 256 $\mu$g/m1 이상으로 ceftazidime의 16-256 $\mu$g/mL 이상보다 높은 분포를 보였다. 즉, CTX-M형 ESBL 유전자를 지닌 균주에 대한 cefotaxim의 MIC는 ceftazidime의 MIC에 비해서 상대적으로 높은 양상을 보였다. 이러한 결과는 국내의 대학병원 뿐 만 아니라 일반종합병원에서도 CTX-M형 ESBL 생성 E. coli와 K. pneumoniae가 존재하며 확산 중임을 시사한다. 앞으로 CTX-M형 ESBL의 만연과 변종 CTX-M형 ESBL의 출연을 감시하기 위한 정기적인 연구와 조사가 필요한 것으로 생각한다.