• 제목/요약/키워드: immunoprecipitation

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뇌 유구낭미충증 각자 혈청 및 뇌척수액에서의 유구낭미충 낭액항원의 측정 (Measurement of 150 kDa protein of Taenia solium metacestodes by antibody-sandwich ELISA In cerebrospinal fluld of neurocystlcercosls patients)

  • 조승열;공윤;김석일;강신영
    • Parasites, Hosts and Diseases
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    • 제30권4호
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    • pp.299-307
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    • 1992
  • 뇌 유구낭미충증 진단에는 영상진단을 가장 널리 이용하고 있으나 낭미충증의 영상진단은 감염충체수, 감염경과 기간, 감염위치 및 포도낭미충 존재여부 등에 따라 소견이 매우 다양하므로 감별진단에 도움이 되는 혈청학적 진단이 요구된다. 이때에 이용하는 혈청학적 진단 방법은 특이항체를 혈청이나 뇌척수액에서 증명하는 것이나 몇 가지 경우에 위음성 반응을 나타내어 민감도가 낮은 결점이 있다. 민감도가 낮은 경우를 해결하는 방법으로시, 또 기생충에서 유래하는 특이항원을 측정함으로써 항체측정 때 나타나는 교차반응을 최소화하고, 충체검 출에 준하는 진단방법으로서 유구낭미충 특이항원을 환자 혈청 및 뇌척수액에서 측정하는 연구를 시도하고 있다. 이 연구에서는 유구낭미층중 환자에서 이중항체-효소면역 측정 법을 실시하여 유구낭미충의 낭액 항원의 구성 단백질을 측정하였다. 항원반응용 항체로는 낭액으로 감작시킨 토끼혈청과, 낭액을 구성하는 단백질중 150 kDa 에만 반응하는 단클론항체를 이용하였다. 이중항체-효소면역측정 법으로는 150 kDa단백질을 8ng/ml까지 측정할 수 있었고, 61ng/m1 이상에서는 농도에 따른 흡광도 차이가 적었다. 이 방법으로 스파르가눔, 간흡충, 폐흡충, 요꼬가와흡충, 간질, 고래회충 제 3기유충 및 선모충 등의 생리식염수 추출액을 검색한 바 모두 음성반응이어서 특이도가 높다고 판단하였다. 뇌 유구낭미충증으로 진단한 환자 255명의 혈청 351개를 측정한 바 측정 가능범위 에 미치지 못하여 모두 음성이었다. 환자 212명에서 얻은 뇌척수액 276개 중 31개 (11.2%)는 양성이었다. 이와 같이 민감도가 낮아 항인측정법은 진단용으로 이용하기 어렵다고 생각하였다. 뇌척수액에서 150kDa단백질이 증 멸된 환자는 프라지관텐 치료 후 2일이 경과한 경우, 그리고 약제치료에도 불구하고 임상결과가 불량하여 결국 외과적으로 충체를 제거한 바 낭벽이 초점 성으로 변성된 포도낭미충에 감염되었던 환자의 뇌척수액에서 불규칙하게, 양적으로는 일정하지 않게 출현하였다. 150kDa 단백질은 뇌 낭종성 병변에서 채취한 낭미충 낭액에서도 측점할 수 있었다. 그리고 150kDa단백질의 농도가 61 ng/ml이상인 뇌척수액이나 외과적으로 얻은 낭액으로 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동을 실시하여 150kDa 단백질의 subunit인 15, 10, 7kDa를 증명할 수 있었다.

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Hypoxia Inducible Factor-1α Directly Regulates Nuclear Clusterin Transcription by Interacting with Hypoxia Response Elements in the Clusterin Promoter

  • Park, Jeongsook;Park, So Yun;Shin, Eunkyung;Lee, Sun Hee;Kim, Yoon Sook;Lee, Dong Hoon;Roh, Gu Seob;Kim, Hyun Joon;Kang, Sang Soo;Cho, Gyeong Jae;Jeong, Bo-Young;Kim, Hwajin;Choi, Wan Sung
    • Molecules and Cells
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    • 제37권2호
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    • pp.178-186
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    • 2014
  • Differential transcription of the clusterin (CLU) gene yields two CLU isoforms, a nuclear form (nCLU) and a secretory form (sCLU), which play crucial roles in prostate tumorigenesis. Pro-apoptotic nCLU and anti-apoptotic sCLU have opposite effects and are differentially expressed in normal and cancer cells; however, their regulatory mechanisms at the transcriptional level are not yet known. Here, we examined the transcriptional regulation of nCLU in response to hypoxia. We identified three putative hypoxia response elements (HREs) in the human CLU promoter between positions -806 and +51 bp. Using a luciferase reporter, electrophoretic gel mobility shift, and chromatin immunoprecipitation assays, we further showed that hypoxia-inducible factor-$1{\alpha}$ (HIF-$1{\alpha}$) bound directly to these sites and activated transcription. Exposure to the hypoxia-mimetic compound $CoCl_2$, incubation under 1% $O_2$ conditions, or overexpression of HIF-$1{\alpha}$ enhanced nCLU expression and induced apoptosis in human prostate cancer PC3M cells. However, LNCaP prostate cancer cells were resistant to hypoxia-induced cell death. Methylation-specific PCR analysis revealed that the CLU promoter in PC3M cells was not methylated; in contrast, the CLU promoter in LNCap cells was methylated. Co-treatment of LNCaP cells with $CoCl_2$ and a demethylating agent promoted apoptotic cell death through the induction of nCLU. We conclude that nCLU expression is regulated by direct binding of HIF-$1{\alpha}$ to HRE sites and is epigenetically controlled by methylation of its promoter region.

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation before- and after Exercise in the Thoroughbred Horse with MeDIP-Seq

  • Gim, Jeong-An;Hong, Chang Pyo;Kim, Dae-Soo;Moon, Jae-Woo;Choi, Yuri;Eo, Jungwoo;Kwon, Yun-Jeong;Lee, Ja-Rang;Jung, Yi-Deun;Bae, Jin-Han;Choi, Bong-Hwan;Ko, Junsu;Song, Sanghoon;Ahn, Kung;Ha, Hong-Seok;Yang, Young Mok;Lee, Hak-Kyo;Park, Kyung-Do;Do, Kyoung-Tag;Han, Kyudong;Yi, Joo Mi;Cha, Hee-Jae;Ayarpadikannan, Selvam;Cho, Byung-Wook;Bhak, Jong;Kim, Heui-Soo
    • Molecules and Cells
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    • 제38권3호
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    • pp.210-220
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    • 2015
  • Athletic performance is an important criteria used for the selection of superior horses. However, little is known about exercise-related epigenetic processes in the horse. DNA methylation is a key mechanism for regulating gene expression in response to environmental changes. We carried out comparative genomic analysis of genome-wide DNA methylation profiles in the blood samples of two different thoroughbred horses before and after exercise by methylated-DNA immunoprecipitation sequencing (MeDIP-Seq). Differentially methylated regions (DMRs) in the pre-and post-exercise blood samples of superior and inferior horses were identified. Exercise altered the methylation patterns. After 30 min of exercise, 596 genes were hypomethy-lated and 715 genes were hypermethylated in the superior horse, whereas in the inferior horse, 868 genes were hypomethylated and 794 genes were hypermethylated. These genes were analyzed based on gene ontology (GO) annotations and the exercise-related pathway patterns in the two horses were compared. After exercise, gene regions related to cell division and adhesion were hypermethylated in the superior horse, whereas regions related to cell signaling and transport were hypermethylated in the inferior horse. Analysis of the distribution of methylated CpG islands confirmed the hypomethylation in the gene-body methylation regions after exercise. The methylation patterns of transposable elements also changed after exercise. Long interspersed nuclear elements (LINEs) showed abundance of DMRs. Collectively, our results serve as a basis to study exercise-based reprogramming of epigenetic traits.

큰입우럭(Micropterus salmoides) 조직의 젖산탈수소효소 및 Monocarboxylate 수송체(MCT) 1, 2, 4 (Lactate Dehydrogenase and Monocarboxylate Transporters 1, 2, and 4 in Tissues of Micropterus salmoides)

  • 염정주;연준희
    • 생명과학회지
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    • 제22권1호
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    • pp.98-109
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    • 2012
  • 큰입우럭(Micropterus salmoides) 조직의 젖산탈수소효소(EC 1.1.1.27, LDH)의 특성 및 골격근과 심장조직의 monocarboxylate 수송체 1, 2, 4의 발현을 연구하였다. Native-PAGE 결과골격근에서 LDH $A_4$, 심장, 간, 눈 및 뇌조직에서 $A_4$, $A_2B_2$, $B_4$, 눈조직에서 eye-specific $C_4$ 동위효소가 발현되었다. 9월에 심장조직에서 LDH $B_4$ 동위효소의 활성이 강하고 다른 조직에서는 $A_4$의 활성이 강했으나, 11월에 심장조직에서 $A_4$ 동위효소의 활성이 강하게 확인되었다. 골격근과 심장조직에서 LDH/CS로 조직의 혐기적 대사 비율이 높게 확인되었으며, 면역 침강 후 native-PAGE에 의해 LDH eye-specific $C_4$ 동위효소가 $B_4$보다 $A_4$ 동위효소에 더 유사한 것으로 확인되었다. LDH $A_4$ 동위효소가 affinity chromatography에 의해 정제되었고, 하부단위체 A의 분자량은 37.200이었다. 피루브산 10 mM에서 조직 LDH의 활성이 11.05-28.32% 남아 저해 정도가 컸고, 눈조직 LDH의 $K_m^{PYR}$이 낮았으며, 조직의 최적 pH는 7.5~8.0이였다. 골격근 미토콘드리아에서 LDH $A_4$ 동위효소, 심장조직의 미토콘드리아에서 $B_4$$A_2B_2$ 동위효소가 확인되었고, 골격근과 심장조직의 원형질막과 미토콘드리아에서 MCT 1, 2, 4가 확인되었다. 골격근 MCT 1, 2, 4 골격근 MCT 1 60 kDa, MCT 2 54~38 kDa, MCT 4 63 kDa, 심장조직 MCT 1 57 kDa, MCT 2 54~38 kDa 및 MCT 4 55.5 kDa이었다. 실험 결과, 큰입우럭이 저산소 조건에 적응되어져 혐기적 대사가 우세하고, 활성이 큰 골격근과 심장조직에서 원형질막과 미토콘드리아 MCT 1, 2, 4를 통해 젖산과 피루브산이 유입되고 유출되며 LDH에 의해 에너지 생성을 효율적으로 조정하는 것으로 사료된다.

Cadms/SynCAMs/Necls/TSLCs와 multi-PDZ domain protein MUPP1 단백질의 결합 (Cadms/SynCAMs/Necls/TSLCs Interact with Multi-PDZ Domain Protein MUPP1)

  • 장원희;정영주;최선희;김상진;엄상화;문일수;석대현
    • 생명과학회지
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    • 제24권12호
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    • pp.1276-1283
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    • 2014
  • 조직의 구조 안정성을 유지하는 세포 사이 연접복합체는 multi-PDZ domain protein 1 (MUPP1)을 포함하여 50종류 이상의 단백질로 이루어져 있다. MUPP1은 13개의 PDZ 도메인을 가지는 단백질로서 막경유(transmembrane) 단백질과 세포골격단백질이나 신호단백질 사이에서 scaffold로 작용한다고 알려져 있지만, MUPP1이 어떻게 세포막인접 단백질들을 연결하고 구조 안정화에 기여하는지에 대해 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 MUPP1의 PDZ 도메인과 상호 작용하는 단백질을 규명하기 위하여 효모 two-hybrid 방법을 이용, cell adhesion molecule 1 (Cadm1; SynCAM1, Necl-2 또는 TSLC1로도 알려짐)이 MUPP1과 결합하는 것을 확인하였다. Cadm1은 MUPP1의 2번째 PDZ 도메인과 결합하며, Cadm1의 C-말단에 존재하는 II 형 PDZ-결합모티프(-Y-F-I)가 MUPP1과의 결합에 필수적임을 확인하였다. 또한 MUPP1은 다른 Cadm family 단백질들인 Cadm2, Cadm3, 그리고 Cadm4와도 결합하며, 이러한 단백질간 결합은 glutathione S-transferase (GST) pull-down assay와 공동면역침강으로도 추가 확인하였다. 생쥐의 뇌 파쇄액을 MUPP1 항체로 면역침강하였을 때 Cadm1과 Cadm4가 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 MUPP1이 세포 사이 연접에서 Cadms와 세포골격 단백질 사이를 연결한다는 것을 시사한다.

JSAP1과 Kinesin Light Chain 1의 결합 및 결합부위 규명 (JSAP1 Interacts with Kinesin Light Chain 1 through Conserved Binding Segments)

  • 김진상;이철희;박혜영;예성수;장원희;이상경;박영홍;차옥수;문일수;석대현
    • 생명과학회지
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    • 제17권7호통권87호
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    • pp.889-895
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    • 2007
  • KIF5는 2분자의 kinesin heavy chain (KHC)과 2분자의 kinesin light cham (KLC)으로 구성되며 미세소관과 직접 결합한다. KIF5는 여러가지 세포 내 소기관을 이동시키나 KIF5가 이동시키는 운반체가 어떻게 특이적으로 결합하는지는 아직 밝혀지지 못하였다. 본 연구에서 효모 two-hybrid system을 사용하여 KLC1의 tetratricopeptide repeats (TRP) 부위와 결합하는 세포 내의 단백질을 분리하였다. 결과 KLC1와 특이적으로 결합하는JNK/stress-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1/JIP3)을 분리하였다. 이러한 결합은 KLC1의 TRP1, 2 영역과 JSAP1의 leucine zipper 영역이 결합에 관여하며, 또한 효모 two-hybrid assay에서 JSAP1은 KLC2와 결합하지만 신경세포에서 발현하는 KIF5A, KIF5C 그리고 모든 세포에서 발현하는 KIF5B와는 결합하지 않았다. 단백질간의 결합을 pull-down assay로 확인한 결과 KLC1은 glutathione S-transferase (GST)와는 결합하지 않으나 GST결한 JSAP1과는 결합하였다. 또한 생쥐의 뇌 파쇄 액으로부터 JSAP1 항체로 면역침강을 행한 결과 KLC1은 JSAP1과 같이 침강하였다. 이러한 결과들은 KLC1은 JSAP1과 결합하며, JSAP1은 KLC1의 수용체로세포 내 KIF5의 수송의 매개 단백질로 작용함을 시사한다.

생애 초기 유해 경험이 우울증의 발병과 p11 유전자의 후성유전기전에 미치는 영향 (Effects of Early Life Stress on the Development of Depression and Epigenetic Mechanisms of p11 Gene)

  • 서미경;최아정;이정구;엄상화;박성우;석대현
    • 생명과학회지
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    • 제29권9호
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    • pp.1002-1009
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    • 2019
  • 생애 초기 유해 경험은 우울증의 위험성을 높이며, 성인기 스트레스의 민감성에 영향을 미칠 수 있다. 출생 후 모성 분리(MS)로 인한 성인기 스트레스(장기간 예측 불가능한 스트레스; CUS)의 취약성에 p11 유전자의 후성유전기전이 영향을 미치는 지를 확인하였다. 출생 직후부터 21일 동안 하루 3시간 동안 새끼 생쥐를 어미 생쥐로부터 분리시켜 새끼 생쥐가 성체가 되었을 때 CUS를 3주 동안 매일 적용하였다. Real time PCR기법으로 해마의 p11 발현 양을 측정하였고, 염색질 면역 침전 분석법으로 p11 promoter의 히스톤 H3 아세틸화 및 메틸화 양을 측정하였다. 강제수영검사에서 우울 유사 행동을 측정하였다. MS군 및 CUS군은 p11 mRNA 발현 양을 유의하게 감소시켰으며, MS+CUS군은 CUS군에 비해 p11 발현 양을 유의하게 증가시켰다. 또한 MS+CUS군은 CUS군에 비해 H3 아세틸화를 감소시켰다. 이러한 감소는 HDAC5 mRNA 발현 증가와 일치하였다. MS+CUS군은 CUS군에 비해 H3K4 메틸화를 감소시켰으며, H3K27 메틸화를 증가시켰다. 강제수영검사에서 p11 발현이 가장 많이 감소된 MS+CUS군이 대조군에 비해 더 긴 부동 시간을 나타내었다. 출생 후 모성 분리를 경험하고 성체 기간에 스트레스를 함께 받은 생쥐는 성체기간에만 스트레스를 받은 생쥐보다 훨씬 더 큰 후성유전 변화를 보여주었다. 생애 초기 유해 경험은 해마에서 p11 유전자의 히스톤 변형을 통해 성체 스트레스 효과를 더 악화시키는 것으로 생각된다.

조기 난소 부전증 유발 관련 단백질인 FOXL2의 새로운 결합 단백질 UBE2I의 발견 (Discovery of UBE2I as a Novel Binding Protein of a Premature Ovarian Failure-Related Protein, FOXL2)

  • 박미라;정현숙;김현리;;하혜정;이강석;배지현;고정재
    • 한국발생생물학회지:발생과생식
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    • 제12권3호
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    • pp.289-296
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    • 2008
  • BPES($\underline{B}$lepharophimosis/$\underline{P}$tosis/$\underline{E}$picanthus inversus $\underline{S}$yndrome)는 FOXL2 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 상염색체 우성질환이다. 눈꺼풀이 갈라지거나 쳐지고 넓은 미간이 나타나는 특징이 있으며, 여성의 조기 난소 부전증(premature ovarian failure, POF)을 일으켜 불임을 유발한다. FOXL2는 forkhead family에 속하는 전사인자로서 FOXL2가 결여된 난소에서는 granulosa cell의 분화가 진행되지 않아 난포 성숙과정의 멈춤과 난자의 폐쇄증을 유발한다. FOXL2를 bait로 하여 rat의 난소 cDNA 라이브러리의 yeast two-hybrid screening을 시행하여 FOXL2 단백질과 상호작용을 하는 small ubiquitin-related modifier(SUMO)-conjugating E2 효소인 UBE2I 단백질을 찾았다. UBC9이라고도 알려진 UBE2I 단백질은 SUMO 변형 과정을 위한 필수적인 단백질이다. Sumoylation은 수 많은 전사인자의 전사능력의 조절을 포함하여 다양한 신호전달체계에 관여하는 번역 후 변형 과정이다. 본 연구에서 인간세포인 293T 내에서 면역침전반응 실험을 통해 FOXL2와 UBE2I의 단백질-단백질간의 상호작용을 확인하고, FOXL2의 돌연변이형을 제작하여 yeast two-hybrid system을 이용해 UBE2I와 결합에 필요한 FOXL2의 부분을 규명하였다. 따라서, FOX2에 상호작용하는 UBE2I의 규명은 sumoylation에 의한 FOXL2의 새로운 조절 메커니즘을 시사한다.

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Ginsenoside compound K protects against cerebral ischemia/ reperfusion injury via Mul1/Mfn2-mediated mitochondrial dynamics and bioenergy

  • Qingxia Huang;Jing Li;Jinjin Chen;Zepeng Zhang;Peng Xu;Hongyu Qi;Zhaoqiang Chen;Jiaqi Liu;Jing Lu;Mengqi Shi;Yibin Zhang;Ying Ma;Daqing Zhao;Xiangyan Li
    • Journal of Ginseng Research
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    • 제47권3호
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    • pp.408-419
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    • 2023
  • Background: Ginsenoside compound K (CK), the main active metabolite in Panax ginseng, has shown good safety and bioavailability in clinical trials and exerts neuroprotective effects in cerebral ischemic stroke. However, its potential role in the prevention of cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury remains unclear. Our study aimed to investigate the molecular mechanism of ginsenoside CK against cerebral I/R injury. Methods: We used a combination of in vitro and in vivo models, including oxygen and glucose deprivation/reperfusion induced PC12 cell model and middle cerebral artery occlusion/reperfusion induced rat model, to mimic I/R injury. Intracellular oxygen consumption and extracellular acidification rate were analyzed by Seahorse multifunctional energy metabolism system; ATP production was detected by luciferase method. The number and size of mitochondria were analyzed by transmission electron microscopy and MitoTracker probe combined with confocal laser microscopy. The potential mechanisms of ginsenoside CK on mitochondrial dynamics and bioenergy were evaluated by RNA interference, pharmacological antagonism combined with co-immunoprecipitation analysis and phenotypic analysis. Results: Ginsenoside CK pretreatment could attenuate mitochondrial translocation of DRP1, mitophagy, mitochondrial apoptosis, and neuronal bioenergy imbalance against cerebral I/R injury in both in vitro and in vivo models. Our data also confirmed that ginsenoside CK administration could reduce the binding affinity of Mul1 and Mfn2 to inhibit the ubiquitination and degradation of Mfn2, thereby elevating the protein level of Mfn2 in cerebral I/R injury. Conclusion: These data provide evidence that ginsenoside CK may be a promising therapeutic agent against cerebral I/R injury via Mul1/Mfn2 mediated mitochondrial dynamics and bioenergy.

가물치(Channa argus) 젖산탈수소효소 동위효소들의 정제 및 특성 (Purification and Characterization of Lactate Dehydrogenase Isozymes in Channa argus)

  • 박은미;염정주
    • 생명과학회지
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    • 제20권2호
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    • pp.260-268
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    • 2010
  • 가물치(Channa argus) 조직의 젖산탈수소효소 동위효소(EC 1.1.1.27, lactate dehydrogenase, LDH)를 정제하고 생화학적, 면역학적 및 역학적 방법으로 특성을 연구하였다. LDH 활성은 골격근이 380.4 units로 가장 높고 심장 13.4, 눈 3.5, 뇌 조직 5.4 units이었으며, 심장의 CS 활성은 20.7 unit로 가장 높고, LDH/CS는 골격근 172.9, 심장 0.6, 눈 0.32, 뇌 0.47이고, 단백질 양은 골격근 14.7 mg/g이며, 특이활성(units/mg)은 골격근 25.88, 심장 0.79, 눈 0.31, 뇌 1.38 units/mg이었으므로 골격근은 혐기적이고, 심장은 호기적이었다. LDH $A_4$, $B_4$, eye-specific $C_4$에 대한 항혈청을 사용한 Western blot, 면역침강반응 및 native-polyacrylamide gel electrophoresis에 의해 $A_4$, $A_3B$, $A_2B_2$, $AB_3$$B_4$가 모든 조직에서 확인되었고, 눈 조직에서 $C_4$$AC_3$, $A_2C_2$, $AC_3$, 뇌 조직에서 $A_3C$도 확인되었다. LDH $A_4$, $A_3B$, $A_2B_2$, $AB_3$, $B_4$, eye-specific $C_4$ 동위효소는 affinity chromatography와 Preparative PAGE Cell에 의해 정제되었다. LDH $A_4$ 동위효소는 $NAD^+$ 유입 후 정제되었고, eye-specific $C_4$$A_4$에 이어 용출되기 시작하였으며 $B_4$는 buffer 유입 후 용출되었다. 정제한 결과 $A_4$$B_4$ 및 eye-specific $C_4$와 분자구조의 일부가 유사하였지만 $B_4$$C_4$는 서로 다른 것으로 나타났으므로, 하부단위체 A는 보존적이고, 하부단위체 B는 A보다 더 빠르게 진화된 것으로 보인다. 피루브산 10 mM에서 $A_4$ 동위효소 39.98%, $A_2B_2$ 21.28%, $B_4$ 19.67% 및 eye-specific $C_4$ 16.87%의 활성이 남아있었고, 피루브산에 대한 $Km^{PYR}$$A_4$ 0.17 mM, $B_4$ 0.27 mM, eye-specific $C_4$ 0.133 mM였다. $A_4$, $B_4$, eye-specific $C_4$, $A_2B_2$, $A_3B$$AB_3$의 최적 pH는 각각 pH 6.50, pH 8.5, pH 5.5, pH 6.0-6.5, 5.0 및 pH 7.5였고, 동질사량체 $A_4$와 이질사량체 동위효소들은 넓은 pH 영역에서 안정하였다. 특히 골격근은 LDH 활성이 크므로 활동성이 크며, 눈조직에서 피루브산 친화력이 강한 eye-specific $C_4$에 의해 피루브산 대사가 빠르게 일어나고, 이어서 $A_4$에 의해 젖산이 산화되어지는 것으로 사료되므로, 종의 생태환경 및 먹이 획득 양식에 따라 LDH-C 발현, 기질에 대한 친화도 및 대사 시간이 다른 것으로 사료된다.