• 생명과학회지
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• 제22권11호
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• pp.1545-1551
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• 2012

이전 연구에서 저자들이 Glycoside hydrolase family 50 (GH-50)과 GH-118 ${\beta}$-agarase들의 발현과 특성을 보고한 Agarivorans sp. JA-1 균주로부터 신규의 GH-16 ${\beta}$-agarase를 보고하고자 한다. 본 유전자는 1,362 염기쌍으로 구성되어 있으며, 453 아미노산 잔기로 구성된 49,830 Da의 단백질을 암호화한다. 본 효소는 Pseudoalteromonas sp. CY24 유래의 GH-16 ${\beta}$-agarase와 98%의 염기서열 상동성과 99%의 아미노산서열 상동성을 나타냈다. 신호서열을 제외한 429 아미노산으로 구성된 성숙단백질에 해당하는 유전자를 E. coli BL21 (DE3) 세포에서 재조합 발현시킨 후, 친화성 크로마토그래피로 효소를 정제하였다. 정제된 효소는 $40^{\circ}C$와 pH 5.0에서 67.6 U/mg의 최적 활성을 보였다. 아가로스를 기질로 한 효소분해산물의 박막크로마토그래피 분석결과, neoagarohexaose와 neoagarotetraose가 주산물로 생산되는 것을 알 수 있었다. 본 효소는 기능성 한천올리고당의 산업적 생산에 활용 가능할 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제22권2호
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• pp.266-280
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• 2012

한천은 거대 홍조류의 세포벽 성분으로 agarase에 의해 가수분해된다. Agarase는 분해 양상에 따라 ${\alpha}$-agarase (E.C. 3.2.1.158)와 ${\beta}$-agarase (E.C. 3.2.1.81)로 나눌 수 있으며 아미노산 서열 유사성에 따라 GH (glycoside hydrolase) -16, -58, -86, -96, -118 로 나눌 수 있다. 많은 agarase들이나 그들의 유전자가 바다나 육지 환경의 세균 혹은 메타게놈에서 검출, 분리, 재조합 발현되었다. Agarase의 산물인 한천올리고당(agarooligosaccharides)과 네오한 천올리고당(neoagarooligosaccharides)은 항암, 면역활성, 항산화, 장내유용세균활성화, 간보호, 항균, 미백, 보습의 효과 등 다양한 기능성이 보고되어 식품, 화장품, 의학 영역에서 광범위하게 이용될 수 있다. 또한 agarase는 연구영역에서 이용될 수 있다. 이 논문은 agarase의 검출원, 정제법, 검출법 그리고 응용영역에 대해 검토하였고, 한천대사에서 agarase의 역할, 대사산물의 기능 등도 고찰하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권11호
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• pp.1753-1759
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• 2006

Paenibacillus sp. HY-8 isolated from the digestive tracts of the longicorn beetle, Moechotypa diphysis, produced an extracellular endoxylanase with a molecular weight of 20 kDa estimated by SDS-PAGE. The xylanase was purified to near electrophoretic homogeneity from the culture supernatant after ammonium sulfate precipitation, gel filtration, and ionexchange chromatography. The purified xylanase exhibited the highest activities at pH 6.0 and $50^{\circ}C$. The $K_m\;and\;V_{max}$ values were 7.2 mg/ml and 16.3 U/mg, respectively, for birchwood xylan as the substrate. Nucleotide sequence of the PCR-cloned gene was determined to have the open reading frame encoding a polypeptide of 212 amino acids. The N-terminal amino acid sequence and the nucleotide sequence analyses predicted that the precursor xylanase contained a signal peptide composed of 28 amino acids and a catalytically active 19.9-kDa peptide fragment. The deduced amino acid sequence shared extensive similarity with those of the glycoside hydrolase family 11 of xylanases from other bacteria. The predicted amino acid sequence contained two glutamate residues, previously identified as essential and conserved for active sites in other xylanases of the glycoside hydrolase family 11.

• 한국해양바이오학회지
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• 제8권1호
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• pp.1-9
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• 2016

The hydrolysis of biomass to fermentable sugar (saccharification) and to oligosaccharide is an essential process in biotechnology including biorefinery and biofood. Various macroalgae are commercially cultivated in several Asian countries as a useful resource for food and agar production. Agar is a major component of the cell walls of red algae that can be hydrolyzed by agarase. Agarases are classified into ${\alpha}$-agarase (E.C. 3.2.1.158) and ${\beta}$-agarase (E.C. 3.2.1.81) according to the cleavage pattern and grouped in the glycoside hydrolase (GH) family (GH-16, GH-58, GH-86, GH-96, and GH-118) based on the amino acid sequences of the proteins. Agarases have been isolated from various bacteria found in seawater and marine sediments. To increase productivity of the enzyme, a research on recombinant enzymes has been done. The application of recombinant agarase can be possible in the various filed such as energy, food, cosmetics, medical and so on. This paper reviews the source, biochemical characteristics and production system of recombinant agarases for further study.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권3호
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• pp.257-264
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• 2009

A $\beta$-agarase gene, agaB34, was functionally cloned from the genomic DNA of a marine bacterium, Agarivorans albus YKW-34. The open reading frame of agaB34 consisted of 1,362 bp encoding 453 amino acids. The deduced amino acid sequence, consisting of a typical N-terminal signal peptide followed by a catalytic domain of glycoside hydrolase family 16 (GH-16) and a carbohydrate-binding module (CBM), showed 37-86% identity to those of agarases belonging to family GH-16. The recombinant enzyme (rAgaB34) with a molecular mass of 49 kDa was produced extracellularly using Escherichia coli $DH5{\alpha}$ as a host. The purified rAgaB34 was a $\beta$-agarase yielding neoagarotetraose (NA4) as the main product. It acted on neoagarohexaose to produce NA4 and neoagarobiose, but it could not further degrade NA4. The maximal activity of rAgaB34 was observed at $30^{\circ}C$ and pH 7.0. It was stable over pH 5.0-9.0 and at temperatures up to $50^{\circ}C$. Its specific activity and $k_{cat}/K_m$ value for agarose were 242 U/mg and $1.7{\times}10^6/sM$, respectively. The activity of rAgaB34 was not affected by metal ions commonly existing in seawater. It was resistant to chelating reagents (EDTA, EGTA), reducing reagents (DTT, $\beta$-mercaptoethanol), and denaturing reagents (SDS and urea). The E. coli cell harboring the pUC18-derived agarase expression vector was able to efficiently excrete agarase into the culture medium. Hence, this expression system might be used to express secretory proteins.

• Applied Biological Chemistry
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• 제48권1호
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• pp.16-22
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• 2005

키토산분해효소(Chitosanases, EC 3.2.1.132)는 당질가수분해효소군의 하나로, 아미노당인 D-glucosamine polymer인 chitosan의 ${\beta}-1,4-glycoside$ 결합을 가수분해하는 효소이며, 세균, 곰팡이, 식물 등에 널리 분포한다. 본 논문에서는 chitosanase의 N-말단 아미노산의 서열과 입체구조에 근거한 family 및 clan 분류, 작용모형, 절단 유형, subclass 분류, 및 family-subclass 상관성을 검토하였다. 아미노산 서열과 입체구조와 기질의 분해패턴 사이에는 깊은 상관이 있음을 확인 제시하였다. 다양한 종 유래 chitosanase의 1차구조의 해명과 진화적 상관 규명, 나아가 보다 정교한 chitosanase의 정의와 다양한 산업적 응용에의 가능성도 검토하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제29권2호
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• pp.235-243
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• 2019

A special eosinophilic agarase exo-type ${\beta}$-agarase gene, AgaDL6, was cloned from a marine agar-degrading bacterium, Flammeovirga sp. HQM9. The gene comprised 1,383-bp nucleotides encoding a putative agarase AgaDL6 of 461 amino acids with a calculated molecular mass of 52.8 kDa. Sequence analysis revealed a ${\beta}$-agarase domain that belongs to the glycoside hydrolase family (GH) 16 and a carbohydrate-binding module (CBM_4_9) unique to agarases. AgaDL6 was heterologously expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). Enzyme activity analysis of the purified protein showed that the optimal temperature and pH of AgaDL6 were $50^{\circ}C$ and 3.0, respectively. AgaDL6 showed thermal stability by retaining more than 98% of activity after incubation for 2 h at $50^{\circ}C$, a feature quite different from other agarases. AgaDL6 also exhibited outstanding acid stability, retaining 100% of activity after incubation for 24 h at pH 2.0 to 5.0, a property distinct from other agarases. This is the first agarase characterized to have such high acid stability. In addition, we observed no obvious stimulation or inhibition of AgaDL6 in the presence of various metal ions and denaturants. AgaDL6 is an exo-type ${\beta}$-1,4 agarase that cleaved agarose into neoagarotetraose and neoagarohexaose as the final products. These characteristics make AgaDL6 a potentially valuable enzyme in the cosmetic, food, and pharmaceutical industries.

• 생명과학회지
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• 제22권7호
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• pp.912-919
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• 2012

Carboxymethylcellulose (CM-cellulose)와 Beechwood xylan을 각각 기질로 사용하여 trypan blue를 첨가하여 제작한 Agar-LB 배지 상에서 명확한 활성환을 형성하는 균주를 cellulase와 xylanase 생산 균주로 단리하였다. 단리한 균주 유래의 16S rRNA 유전자 및 API 50 kit를 분석한 결과 Bacillus subtilis와 약 99.5%의 높은 상동성을 보였기에 본 균주를 Bacillus subtilis로 동정하여 B. subtilis NC1로 명명하였다. B. subtilis NC1 유래 cellulase와 xylanase는 CM-cellulose와 Beechwood xylan에 대하여 각각 높은 효소 활성을 보였으며, 두 효소 모두 pH 5.0과 $50^{\circ}C$의 조건하에서 가장 높은 효소 활성을 보였다. B. subtilis NC1 균주 유래 cellulase와 xylanase 유전자를 cloning하기 위하여 shot-gun cloning 방법을 이용하여 B. subtilis NC1 염색체 DNA로부터 효소 유전자를 cloning하여 유전자 배열을 규명한 결과 cellulase 유전자는 아미노산 499개를 암호화하는 1,500 bp의 open reading frame (ORF)으로 이루어져 있었으며, 아미노산 배열로부터 추정되는 분자량은 55,251 Da 이었다. 그리고, xylanase에 대한 유전자는 아미노산 422개를 암호화하는 1,269 bp의 ORF로 이루어져 있었으며 유전자 유래 아미노산 배열로부터 추정되는 단백질 분자량은 47,423 Da 이었다. 두 효소의 아미노산 배열을 이용하여 상동성을 검토한 결과 cellulase는 glycoside hydrolase family (GH) 5에 속하는 cellulase와 xylanase는 GH30에 속하는 xylanase와 높은 상동성을 나타내었다.

• 생명과학회지
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• 제25권6호
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• pp.680-685
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• 2015

이전에 토양으로부터 cellulase와 xylanase 생산 균주로 단리하였다. 단리한 균주 유래의 16S rRNA 유전자 및 API 50 kit를 분석한 결과 Bacillus subtilis와 약 99.5%의 높은 상동성을 보였기에 본 균주를 B. subtilis NC1으로 명명하였다. Bacillus subtilis NC1 균주 유래 cellulase와 xylanase 유전자를 cloning 하여 유전자 배열을 규명하였다. 또한, 두 효소의 아미노산 배열을 이용하여 상동성을 검토한 결과 cellulase는 Glycoside hydrolase family (GH) 5 그리고 xylanase는 GH30에 속하는 효소임을 밝혔다. 본 연구에서는 B. subtilis NC1 의 cellulase 생산을 위한 배지성분의 최적 농도를 결정하기 위해 중심합성계획법(central composite design, CCD)을 기반으로 한 반응표면 분석법(Response Surface Methodology) 을 수행하였다. 세가지 독립변수로는 tryptone, yeast extract, 그리고 NaCl이 조사되었다. 반응값에 대하여 분산분석을 실시한 결과 결정계수(R²)는 0.96이었으며 전체 모델에 대한 유의확률이 0.0001로 매우 높은 유의성을 지님을 확인하였다. 반응표면분석법을 통하여 얻어진 B. subtilis NC1의 cellulase 활성을 위한 최적화 배지의 각 변수 농도는 tryptone 2.5%, yeast extract 0.5%, 그리고 NaCl 1.0%로 예측 되었다. 최적화 배지에서의 B. subtilis NC1의 cellulase 활성을 검증한 최적화를 실시하기 이전인 대조구의 cellulase 활성 0.5U/ml와 비교하면 24% 활성이 향상된 0.62U/ml의 높은 활성을 보였다.