In a previous study, we identified a Streptomyces sp., A3265, as exhibiting potent antifungal activity against various plant pathogenic fungi, including Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, and Rhizoctonia solani. This strain also exhibited a biocontrolling effect against ginseng root rot and damping-off disease, common diseases of ginseng and other crops. In this study, we isolated two antifungal substances responsible for this biocontrolling effect via Diaion HP-20 and Sephadex LH-20 column chromatography, medium pressure liquid chromatography, and high-performance liquid chromatography. These compounds were identified as guanidylfungin A and methyl guanidylfungin A by spectroscopic methods. These compounds exhibited potent antimicrobial activity against various plant pathogenic fungi as well as against bacteria.
Potato dextrose agar(PDA), V-8 agar, Ginseng extract agar배지에 C. destnctam를 배양한 후 기중균사를 제거하고 25,000 Lux의 광처리로 대형분생포자 생성을 유도한 결과, 암처리에 비해 대형분생포자 생성이 $3.7\~8.1$배 촉진되었다. 위 공시 배지의 액체배지들의 경우에는 광처리에 의해 대형분생포자 생성이 암처리에 비해 $7.7\~18.0$배 촉진되었다. 광처리로서 대형분생포자를 가장 많이 생성한 배지는 PDA와 V-Bagar로 조사되었다. C. destnctans의 대형분생포자 생성에 미치는 광처리 조건중 기중균사 제거 효과를 검토하기 위해 C. destructans가 생육된 Potato dexoose agm에 기중균사를 제거하고 광량별 처리로 대형분생포자 생성량을 측정한 결과, 25,000Lux 의 광처리로 대형분생포자 생성량이 최고 1,585$macroconidia/mm^2$로 측정되어 3,000Lux 및 10,000Lux의 광처리 후 측정된 최고 생성량에 비해 각각 3.2배, 1.4배 많이 생성되었다. 그러나 기중균사 무제거구는 $3,000\~25,000$Lux의 광처리 조건에서 대형분생포자는 $20\~99\;macroconidia/mm^2$의 적은양이 생성되어 광처리시 기중균사 제거는 C. destructans의 대형 분생포자 생성을 촉진하는 것으로 나타났다. 대형분생포자를 구성하는 세포수는 기중균사의 제거 및 무제거와 광량별 처리에 관계없이 $1~3$개로 관찰되었고 2개의 세포로 구성된 것이 $69.4\~100\%$로 대부분을 차지하였다. 광처리로부터 얻어진 대형분생포자는 광처리 6~7일 경과후 부터 분해되기 시작하였다. C. destructans의 기중균사 무제거 상태에서 광처리를 55일간 지속한 결과 광량증가에 따라 균사체가 변형된 후막포자 형성이 촉진되어, 25,000Lux광처리구에서 후막포자 생성량이 1,285$chlamydospres/mm^2$로서 3,000 및 10,000Lux의 경우에 비해 각각 2.8, 1.2배 많이 생성되었다. C. destructans의 기중균사를 제거한 상태로 광을 처리한 경우에는 균사체변형 후 막포자 형성이 더욱 촉진되어 기중균사 제거후 3,000Lux, 10,000Lux, 및 25,000Lux의 각 광처리에서는 기중균사 무제거구의 각 광처리 대조구들에 비해 후막포자가 각각 1.9, 2.5, 1.4배 많이 생성되었다. 균사체변형 후막포자 chain내 세포수는 기중균사 제거 혹은 무제거구의 광 및 암처리에 관계없이 1~8 개이었고 1개의 단독세포로 구성된 것이 $34.2\~58.9\%$로 가장 많았다.
우리나라의 중요(重要) 인삼재배지(人蔘栽培地)인 경기도강화(京畿道江華)에 6년근(年根) 인삼포지(人蔘圃地)를 선정(選定)하여 근부병(根腐病)이 발생(發生)하였던 장소(場所)와 발생(發生)을 않은 장소(場所) 그리고 인삼경작(人蔘耕作)을 않았던 토양(土壤)을 선정(選定)하여 전균류(全菌類) 및 Fusarium sp.의 토양별(土壤別), 토층별(土層別) 분포상태(分布狀態)를 조사(調査)하고 아울러 토양(土壤)의 여러가지 이화학적(理化學的) 성질(性質)을 조사(調査)한 결과(結果), 1. 이병지토양(罹病地土壤)과 무경작지(無耕作地) 토양(土壤)은 토양성질(土壤性質)로서 수분(水分), 유기물함량(有機物含量), 토양입자(土壤粒子)크기로 Silt 함량등(含量等)은 무병지(無病地)보다 다량(多量) 함유(含有)하였으며 무병지(無病地)는 $P_2O_5$, K, Ca 및 토양입자(土壤粒子)로 Cs와 Fs함량(含量)이 이병지(罹病地)와 무경지(無耕地)보다 더 많이 함유(含有)하였다. 그러나 산도(酸度)와 Mg함량(含量)은 차(差)가 없이 모든 토양(土壤)에서 거의 균일(均一)한 상태(狀態)였다. 2. 이병지(罹病地)와 무경작지(無耕作地) 토양(土壤)이 무병지토양(無病地土壤)보다 더 많은 균류(菌類)의 분포(分布)를 나타냈다. 일반적(一般的)으로 표토(表土)에 가까울수록 분포(分布)가 많은 경향(傾向)을 보였으며 근권(根圈)에 특(特)히 많이 분포(分布)하였다. 3. Fusarium sp.는 무경작지(無耕作地) 토양(土壤)에 가장 많이 분포(分布)하였고 이병지(罹病地)가 다음으로 적고 무병지(無病地)는 그 분포(分布)가 제일(第一)적었으며 일반적(一般的)으로 표토층(表土層)에 가까울수록 다수분포(多數分布)하고 탐층(探層)에는 그 분포(分布)가 적어지는 경향(傾向)이었고 특(特)히 근권주위(根圈周圍)에 다수분포(多數分布)하였다.
Around and in the area of Wolgot-Muon, Gimpo-Gun, Kyunggi province, I examined total bacteria, general Pseudomonas spp., fluorescent Pseudomonas spp., in soil layers and also in different kinds of soil of respective diseased, uncultivated, and healthy areas, and found the followings. 1. In the diseased and uncultivated areas, the content of moisture and silt was greater than in the healthy area. 2. Contrary to the above, the healthy area contained a greater amount of inorganic elements such as $P_2O_5$, K, Ca and of soil particle such as Cs and Fs. The degree of pH and content of Mg were even in three types of soils. 3. Total bacteria were found in abundance in the healthy soil. It was observed that in all types of areas, bacteria reside in abundance in the rhizosphere, i.e., 10-15 cm layers and that the closer the surface, the greater the numbers of the bacteria. 4. General Pseudomonas spp. were also found to the greater in number on the surface of the soil, especially so in the rhizosphere, with the numbers decreasing as the soil layers increase. Numbers of this bacteria in all types of area were nearly uniform. 5. A great number of fluorescent Pseudomonas spp. were found in the diseased area, especially so in the rhizosphere.
인삼뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans)후막 포자의 형성은 CD(Czapek`s dox broth)와 SNY(Spezieller Nahrtoffarmer yeast extract broth)배지에서 진탕배양(2$0^{\circ}C$, 120 rpm)하면 양호하였다. 특히 CD배지에서 2$0^{\circ}C$로 30일간 진탕배양하면 5.99 log 후막포자/ml로 형성되었다. 후막포자의 발아율은 12.9~23.3%로 CD배지와 SNY배지에서 좋았으며 발아적온은 5~1$0^{\circ}C$였고, 최적 pH는 6이었다. 그러나 2$0^{\circ}C$이상에서는 전혀 발아하지 않았으며 pH 7.0이상에서는 발아율이 급속히 저하되었다. 인삼추출물 3%, GA 10 ppm, IAA 10 ppm, NOVOZYM\ulcorner234 20 ppm을 처리 할 경우 대조구에 비해 발아율이 증가하였다. 특히 NOVOZYM\ulcorner234 20 ppm 처리구는 발아율이 무처리에 비해 2배 증가하였다. CD배지(pH5)에 NOVOZYM\ulcorner234 20 ppm과 GA 10 ppm을 조합처리하고 5$^{\circ}C$로 정치배양 할 때 후막포자의 발아율은 49.4%로 가장 높았다.
인삼(人蔘)(Panax ginseng C. A. Meyer)의 증산을 제한하는데 가장 큰 요인(要因)은 연작장해이므로 인삼(人蔘)의 증산에 기여할 수 있는 기초자료를 얻기위해 조사(調査)를 실시하였다. 1. 토양(土壤) pH가 F. solani 및 C. destructans의 포자발아(胞子發芽) 그리고 R. solani의 균사생장(菌絲生長)에 미치는 상관관계(相關關係)는 각각 r=0.2645, r=0.315, r=0.19로서 정(正)의 상관(相關)을 나타내었다. 2. 병원균(病原菌)의 포자발아(胞子發芽)와 토양미생물(土壤微生物) 분포수(分布數)와의 관계(關係)를 분석(分析)한 결과(結果), F. solani와 전세균(全細菌), 방선균(放線菌), 섬유소분해(纖維素分解) 세균(細菌)의 분포수(分布數)와의 관계(關係)에서 각각 r=0.21, r=0.37, r=0.20의 정(正)의 상관(相關)을 나타내었으나 전진균(全眞菌)과의 관계(關係)에서는 r=-0.20으로서 부(負)의 상관관계(相關關係)였다. R. solani의 균사생장(菌絲生長)과 방선균(放線菌)의 분포수(分布數)사이에는 정(正)의 상관(相關)(r=0.24)이 있었다. 3. 총 146개 토양(土壤)중에서 F. solani는 40개 토양(土壤)에서, C. destructans는 20개 토양(土壤)에서, R. solani는 9개 토양(土壤)에서 각각 병원균(病原菌) 억제토양(抑制土壤)으로 선발(選拔)되었다. 4. 병원균(病原菌) 억제토양(抑制土壤)의 K, Ca, Mg, Na의 평균함양(平均含量)은 유발토양(誘發土壤)의 것보다 적었으며 병원균(病原菌) 억제토양(抑制土壤)의 유기물함양(有機物含量)은 유발토양(誘發土壤)보다 2배이상 높았다. $P_2O_5$의 함양(含量)은 F. solani와 R. solani의 억제토양(抑制土壤)이 유발토양(誘發土壤)보다 낮은 반면, C. destructans의 억제토양(抑制土壤)은 유발토양(誘發土壤)보다 약간 높았다. 토양(土壤) pH에 있어서 억제토양(抑制土壤)의 평균(平均) pH는 유발토양(誘發土壤)보다 낮은 수치였다. 토양(土壤)의 물리적(物理的) 특성(特性)에 있어서 모래의 평균함양(平均含量)은 병원균(病原菌) 억제토양(抑制土壤)이 유발토양(誘發土壤)보다 2배 정도가 높은 반면, 미사(微砂)와 점사(粘士)의 함양(含量)은 유발토양(誘發土壤)보다 낮았다. 5. 병원균(病原菌) 억제토양(抑制土壤)과 유발토양(誘發土壤)의 미생물분포(微生物分布)는 F. solani 억제토양(抑制土壤)에 있어서 전세균(全細菌), 전진균(全眞菌), 섬유소분해(纖維素分解) 진균(眞菌)의 분포수(分布數)가 유발토양(誘發土壤)보다 높았던 반면, 방선균(放線菌), 섬유소분해(纖維素分解) 세균(細菌)의 분포수(分布數)는 유발토양(誘發土壤)보다 낮았으며, 전세균(全細菌) 및 전진균(全眞菌)의 분포수(分布數)는 병원균(病原菌) 억제토양(抑制土壤)과 유발토양(誘發土壤) 사이에 각각 유의성(有意性)(P=0.05)이 있었고, 방선균(放線菌)은 고도(高度)의 유의성(有意性)(P=0.01)이 두 토양(土壤) 사이에서 인정되었다. C. destructans의 억제토양(抑制土壤)에 있어서 전세균(全細菌), 전진균(全眞菌), 방선균(放線菌), 섬유소분해(纖維素分解) 진균(眞菌)의 분포수(分布數)는 유발토양(誘發土壤)의 분포수(分布數)보다 높았던 반면, 섬유소분해(纖維素分解) 세균(細菌)의 분포수(分布數)는 유발토양(誘發土壤)보다 2배 정도가 낮았다. R. solani의 억제토양(抑制土壤)에 있어서 전진균(全眞菌)의 분포수(分布數)가 유발토양(誘發土壤)의 분포수(分布數)보다 높았던 반면, 전세균(全細菌), 방선균(放線菌), 섬유소분해(纖維素分解) 세균(細菌), 섬유소분해(纖維素分解) 진균(眞菌)의 분포수(分布數)는 유발토양(誘發土壤)보다 낮았다. 6. 인삼근부병(人蔘根腐病) 발병(發病) 억제토양(抑制土壤)의 선발(選拔)은 공시(供試) 병원균(病原菌)별로 인삼(人蔘)이 식재(植栽)된 각각의 16개 토양(土壤)중 F. solani는 14개 토양(土壤)에서, C. destructans는 15개 토양(土壤)에서 각각 발병(發病) 억제성(抑制性)을 확인하였다. F. solani의 발병(發病) 억제토양(抑制土壤)에서 인삼(人蔘)의 근부률(根腐率)은 $1.0{\sim}17.4%$였으며, C. destructans의 발병(發病) 억제토양(抑制土壤)에서 인삼(人蔘)의 근부률(根腐率)은 $0.2{\sim}20.4%$였다.
인삼 연작장해 원인과 경감대책을 수립하고자 2004년에는 2005년까지 작물과학원 증평시험지 연작토양에서 인삼 수확경 과년수와 예정지관리 유무에 따른 시험을 수행한 결과를 요약하면 다음과 같다. 인삼 연작지 수확경과년수가 짧을수록 생존율이 낮아지며 3${\sim}$4년 경과구 81${\sim}$95%의 뿌리썩음 이병주율을 보였다. 예정지 관리구는 미관리구보다 생존율이 다소 높으며 뿌리 썩음병 피해도 예정지 미관리와 같은 경향으로 예정지 관리효과는 크지 않다. 수확경과년수가 10년이상의 연작지에서도 연작장해를 일으키는 병원균 (C. destructans)이 분리되므로 재작 또는 연작시는 이점을 고려하여 재배지를 재선정하거나 예정지 토양관리대책을 수립해야 할 것으로 판단된다.
인삼 뿌리썩음병균 Cylindrocarpon destructans 균사체를 homogenization 단독 처리로 분쇄할 경우 균사체 절편길이는약 400$\mu\textrm{m}$이고 용액내에 복잡하게 뭉쳐있으며 후막포자의 순수분리율은 9.8%로 측정되었다. 그러나 homogenization으로 전처리 한후 초음파 처리를 부가하여 실시한 결과, 처리시간 20초 경과부터 분쇄된 균사체는 용액내에 고루 분포되었고 90초간 초음파 처리후에는 균사체 길이가 20$\mu\textrm{m}$ 정도로 되었으며 전체 후막포자중 74.3%의 후막포자가 균사체로부터 분리되었다. C. destructans 균사체의 homogenization단독처리시 후막포자들의 사슬은 세포수 I~8개로 형성된 것이 관찰되나 초음파를 부가로 처리한 결과 I~4개의 후막포자 세포로 구성된 사슬만이 관찰되었다. 초음파 처리로서 분리된 후막포자 사슬중에서 각 구성세포의 발아율은 potato dextrose agar(PDA)에서 20。C, 2일간배양한 결과 46.8%로 측정되었으며 5줄에서 13일간으로 장기간 배양한 결과 발아율은 60.7%로 측정되었다. C. destructans 균사체를 초음파처리하여 분리된 후막포자는 20。C, PDA배지 배양조건에서 총 후막포자 세포수에 대해 발아한 후막포자 세포의 발아율은 55.8%이며 총 후막포자 사슬군(catenae)에 대해서 발아한 각 후막포자 사슬군의 발아율은 73.4%의 비율로 측정되었다.
인삼부산물 및 인삼밭 토양에서 분리한 9균주 중 𝛽-Glucosidase 생성 균주 GYP-1과 GYP-3-3 균주를 선발하였다. 선발된 𝛽-Glucosidase 생성 균주에 대하여 16S rRNA 유전자 염기서열과 ITS 염기서열을 기반으로 계통 분석을 실시한 결과, GYP-1 균주는 Rhodotorula 속에 속하며, GYP-3-3은 Brachybacterium 속에 속하는 것으로 확인되었다. 특히, Rhodotorula sp. GYP-1 균주는 호기성 효모종으로 biomass 생산량이 높아 최종 우수 균주로 선발하였다. Rhodotorula sp. GYP-1가 생성하는 𝛽-Glucosidase의 온도 및 pH에 따른 효소 활성 및 안정성을 검정한 결과, 30 ℃에서 6.7 unit/ml로 가장 높은 활성을 나타내었고, 20 ℃ ~ 40 ℃에서 효소 활성의 약 70 % 이상을 유지하는 것으로 확인하였다. pH에 따른 효소의 활성 및 안정의 경우, pH 5에서 6.8 unit/ml으로 가장 높은 활성을 나타내었고 pH 5~pH 8까지 93.3 % 이상의 효소 활성을 유지하는 것으로 확인하였다. Rhodotorula sp. GYP-1가 생성하는 𝛽-Glucosidase는 ginsenoside Rb1 minor 진세노사이드로 분해하는 것으로 확인되었다. 또한, 인삼 뿌리 병원균(Botrytis cinerea)에 대해 항진균능을 갖는 것으로 확인되었다.
인삼뿌리썩음병균, Cylindrocarpon destructans(Zins.) Scholten을 접종한 인삼절편으로 부터 얻은 섬유소분해효소 및 펙틴질분해광소의 역가는 그 농도, 시간에 비례하였다. Cellulase (Cx), endo-polygalacturonase(endo-PG), endo-poiymethylgalacturonase (endo-PMG), exo-polygalacturonase (exe-PG)와 exo-polymeth-ylgalacturonase(exo-PMG)의 역가는 접종후 4 일째 최대였으며 endo-PG와 endo-PMG는 1일 및 2일째는 전혀 검출되지 않았으나 exo-PG와 exo-PMG는 검출되었다. 접종후 6 일째에는 모든 펙틴질분해효소는 활성을 완전히 잃었으나 섬유소분해효소는 높은 역가을 유지하였다. Cx, endo-PG, endo-PMG, exo-PG 및 exo-PMG의 최적 pH는 각각 6.0, 5.5, 8.0, 7.0-7.5, 8.5이였다. Cx, endo-PG, endo-PMG, 및 exo-PG의 최적온도는 각각 exo-PMG $66^{\circ}C\;53^{\circ}C\;41^{\circ}C\;37^{\circ}C\;and\;40^{\circ}C$였다. 섬유소분해효소는 공시한 16개 이온중에서 0.05M $Hg^{++}$만이 억제하였다. 펙틴질분해효소는 이온에 따라 상이하였으나 $0.05M\; Fe^{+++}$과 $0.05M\;Al^{+++}$이 가장 현저히 억제하였다. 공시한 8개 농약중에서 어느 것도 $0.1\%$ 유효성분으로는 모든 효소작용을 억제하지 못했으며 exo-PG만은 모든 농약의 의하여 상당히 억제되었다. 그 중에서 Difolatan은 모든 펙틴질분해효소를 가장 잘 억제시켰다. $0.2M\;Ca^{++}$과 $0.02M\;Fe^{+++}$은 펙틴질분해효소를 거의 억제시켰으나 섬유소분해효소는 같은 농도에서 각각 $30\%,\;70\%$에 이르렀다. Formalin은 exo-PG와 endo-PMG를 완전 억제시켰으나 다른 효소 특히 Cx는 그렇지 못했다. $0.8\%$ Difolatan은 모든 효소를 $0.8\%$이상 억제하였으나 Cx는 그 이하였다. C. destructans가 분필하는 섬유소분해효소 및 펙틴질분해효소는 인삼뿌리썩음병과 밀접한 관계를 가지고 있으며 이 병을 효과적으로 방제하기 위하여 억제되어야 하겠다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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제 6 장 손해배상 및 기타사항
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[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.