• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제9권1호
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• pp.23-34
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• 2004

Escherichia coli transcription termination factor Rho catalyzes the unwinding of RNA/DNA duplex in reactions that are coupled to ATP binding and hydrolysis. Fluorescence stopped-flow methods using ATP and the fluorescent 2'(3')-O-( N-methylanthraniloyl) derivatives (mant-derivatives) of ATP and ADP were used to probe the kinetics of nucleotide binding to and dissociation from the Rho-RNA complex. Presteady state nucleotide binding kinetics provides evidence for the presence of negative cooperativity in nucleotide binding among the multiple nucleotide binding sites on Rho hexamer. The binding of the first nucleotide to the Rho-RNA complex occurs at a bimolecular rate of 3.6${\times}$10$\^$6/ M$\^$-1/ sec$\^$-1/ whereas the second nucleotide binds at a slower rate of 4.7${\times}$10$\^$5/ M$\^$-1/ sec$\^$-1/ at 18$^{\circ}C$, RNA complexed with Rho affects the kinetics of nucleotide interaction with the active sites through conformational changes to the Rho hexamer, allowing the incoming nucleotide to be more accessible to the sites. Adenine nucleotide binding and dissociation is more favorable when RNA is bound to Rho, whereas ATP binding and dissociation step in the absence of RNA occurs significantly slower, at a rate ∼70- and ∼40-fold slower than those observed with the Rho-RNA complex, respectively.

• 한국식품영양과학회지
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• 제26권4호
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• pp.743-750
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• 1997

세포막에서의 지방산 이동은 매우 빠르게 일어나므로 방사성 원소를 사용해서는 여러가지 단점이 있고, 정확한 이동속도 측정에도 어려움이 많았다 최근에 개발된 FRET assay는 형광성 물질과 형광성 물질을 상쇄시키는 quencher를 사용한 실험방법 이다. 이는 공명 에너지 이동의 원리를 이용한 것으로 형광광도계, stopped-flow장치를 사용하여 소수성 물질 이동을 직접 컴퓨터 모니터로 측정하는 방법으로 기존방법의 단점을 보완하였다. Donor막에는 형광성 표지를 붙인 지방산이 들어 있고 acceptor막에는 형광을 흡수하는 물질이 들어 있어서 형광성 지방산이 donor에서 acceptor로 이동하면 형광도가 감소하며, 시간에 따른 형광도 감소를 측정하여 지방산 이동속도를 측정하는 방법이다. 형광성 표지를 이용하여 소수성 물질 이동에 사용되는 또 다른 방법은 self-Quenching assay이다. 형광 물질의 농도가 높아지면 서로 형광을 흡수하는 성질을 이용한 방법으로 주로 micelle에서의 물질 이동에 많이 쓰인다. Donor micelle에는 높은 농도의 형광성 지방산이 들어 있고 acceptor micelle에는 형광성 지방산이 들어 있지 않을 때 형광성 지방산이 donor에서 acceptor로 이동하면 형광도가 증가하게 되고 시간에 따른 형광도 증가를 측정하는 방법이다.

• The Korean Journal of Physiology
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• 제28권2호
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• pp.203-214
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• 1994

Using the methods of stopped-flow and epifluorescence microscopy with entrapped fluorophore, membrane permeability of $NH_3$ and weak acids in liposomes, renal brush border (BBMV) and basolateral membrane vesicles (BLMV), and primary culture cells from renal proximal tubule was measured. Permeability coefficient (cm/sec) of $NH_3$ was $(2.9{\times}10^{-2}$ in phosphatidylcholine liposome $25^{\circ}C)$, $5.9{\times}10^{-2}$ in renal proximal tubule cell $(37^{\circ}C)$, $4.0{\times}10^{-2}\;and\;2.4{\times}10^{-2}$ in BBMV and BLMV $(25^{\circ}C)$, respectively. Formic acid has the highest permeability coefficient among the weak acids tested, which was $4.9{\times}10^{-3}$ in liposome, $5.0{\times}10^{-3}$ in renal proximal tubule cell, $9.1{\times}10^{-3}$ in BBMV and $3.8{\times}10^{-3}$ in BLMV. There was a linear relationship between external concentration of nonionized formic acid and initial rate of flux of formic acid in liposome, and the slope coincided with the value of permeability coefficient of formic acid measured in pH 7.0. These results show that techniques of stopped-flow and epifluorescence microscopy with entrapped fluorophore provide the precise method of measurement of very rapid transport of nonelectrolytes through membranes with the advantages of instantaneous mixing effect, good resolution time and easy manipulation.