• 한국미생물·생명공학회지
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• 제41권1호
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• pp.33-43
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• 2013

식품으로서 안전하게 섭취하여 혈전증을 사전에 예방하거나 개선할 수 있도록 하기 위하여, 전통적 방법으로 제조한 청국장으로부터 미생물을 분리하여 혈전분해 효소활성이 우수한 미생물을 선발 동정한 결과, Bacillus amyloliquefaciens HC188이라 명명하였다. 선발미생물이 생산하는 혈전분해효소를 분리 및 정제한 결과, 50.7배의 정제도와 5.5%의 수율을 나타내었고, 혈전분해 효소단백질의 분자량은 22.3 kDa이었으며, N-terminal 아미노산 서열은 Ala-Gln-Ser-Val-Pro-Tyr-Gly-Val-Ser-Gln-Ile-Lys-Ala-Pro-Ala로 분석되었다. 효소의 최적반응 pH와 온도는 pH 8.0과 $40^{\circ}C$로 나타났으며, pH 6.0-8.0과 $20-40^{\circ}C$ 사이에서 효소가 비교적 안정하였다. 금속이온에 대한 영향은 2 mM과 5 mM 농도의 $CoCl_2$와 $CaCl_2$의 금속이온이 존재할 때 효소활성이 증가하였으며, inhibitor로서 EDTA와 PMSF에 의해 효소활성이 저해되므로 청국장에서 분리한 B. amyloliquefaciens HC188가 생성한 혈전분해 효소는 metallo-serine protease로 사료되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제9권4호
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• pp.443-449
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• 1999

Bacillus subtilis BK-17 which produces a novel protease with fibrinolytic activity was isolated from soybean paste. Bioreactor production of the enzyme was studied in order to optimize fermentation conditions such as medium concentration, pH, agitation speed, and temperature. Under most cultural conditions, enzyme production initially began when the cell growth stopped. The onset of the enzyme production was indicated by rapid increase in both dissolved oxygen (DO) and pH. Two- to three-times more concentrated medium than the flask optimum medium yielded higher enzyme production in the bioreactor fermentation. When the medium pH was controlled constant, pH 6.5 exhibited the highest activity in the range of 6.0 to 7.5, but the activity was similar to the case when the pH was initially adjusted to 7.5 and subsequently maintained within a relatively wide range of 6.4 to 7.8. Agitation speed did not affect the enzyme production with an exception of DO reaching zero. Fermentation time was reduced when temperature increased within the range of $25^{\circ}C$ to$37^{\circ}C$. However, the highest activity, along with the slow decrease of the enzymatic activity after reaching the maximum value, was observed at $25^{\circ}C$. By shifting the temperature from $37^{\circ}C$ to $25^{\circ}C$immediately after DO reached the minimum level, the high enzyme production of 1,100 U/ml along with the short fermentation period of 13 h could be obtained.

• 한국식품영양학회지
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• 제18권1호
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• pp.39-47
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• 2005

청국장으로부터 분리한 균을 이용하여 fibrin을 분해 효소활성이 우수한 균주 Bacillus subtilis MG410을 분리한 균주를 이용하여 fibrinolytic enzyme의 생성을 위한 최적 배지 조건을 확립하고자 하였다. 최적 배지 조성은 탄소원 cellobiose 0.5% 첨가시 control보다 균의 성장은 0.5배, 효소 활성은 9배 정도 높은 효과를 보였고, 단당류인 glucose를 첨가시에는 균의 성장은 다소 높았으나 효소활성은 높지 않은 수치를 나타냈다. 질소원으로 soybean meal, soybean peptone을 각각 첨가시 기본배지에서 보다 균의 성장과 효소활성이 높게 나타났고, bacto peptone은 균의 성장은 낮았지만 효소 활성은 높게 나타났다. 그 중 soybean meal을 첨가시에 가장 높은 균의 성장과 효소활성이 나타났다. 질소원 soybean meal 2%를 첨가시 control보다 균의 성장은 6배, 효소 활성은 0.5배 높은 효과를 보였다. 무기질원으로는 Na₂HPO₄·12H₂O을 첨가시 효소생산이 가장 높게 나타났으며, CaCl₂, K₂HPO₄, KH₂PO₄ 첨가시에는 효소 생산에 높은 효과를 보였으나 CuSO₄·5H₂O, CoCl₂·6H₂O 첨가시에는 효소생산 및 균체 생육이 강력히 억제되었다. pH에서는 pH 5가 control보다는 균의 성장은 5배, 효소 활성은 10배 이상 높은 효과를 보였다. 따라서 최적 배지 조성은 탄소원 cellobiose 0.5%, 질소원 soybean meal 2%, 무기질원 Na₂HPO₄·12H₂O 0.02%, pH 5로 조성되었다. 이 조건하에서 배양 37℃, 48시간, 150 rpm에서 효소 생성이 가장 높은 것으로 나타났다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제34권6호
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• pp.904-909
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• 2005

일본 청국장에서 분리된 Bacillus firmus NA-1를 이용하여 비지의 수분함량, 생대두미세분말첨가 및 발효시간에 따른 비지 발효물의 혈전용해효소, 점질물, 펩타이드생산 및 풍미 개선 효과를 알아보았다. 비살균 D-비지는 30시간 이상부터 청국장 발효가 진행되는 반면, 살균 D-비지는 18시간부터 고초균 발효에 의하여 pH가 증가하였으며 혈전분해효소, 펩타이드 함량이 비살균 D-비지보다 높은 값을 보였다 P-비지의 경우는 18시간 발효시에 가장 높은 pH, tyrisone 함량과 혈전용해효소활성을 나타냈다. 또한 P-비지를 건조하여 초기수분함량을 $60\%$로 낮추었을 때 발효비지물의 펩타이드 함량과 혈전용해분해효소활성이 증가하였다. p-비지에 전지활성 생대두미세분말을 $10\%$수준으로 첨가함으로써 혈전분해효소 및 펩타이드 함량이 증가되는 효과를 보였으며, 점질물의 생성에 따른 점조도 값의 증가를 나타내었다. 특히, 콩미세분말을 $20\%$ 수준으로 첨가하여 발효시킨 비지는 고유한 청국장의 풍미를 나타내었으며, 건조시킨 발효비지물의 조단백질함량은 $27.3\%$를 나타내었다. 따라서 비지의 고초균 발효시에 전지활성 생대두미세분말의 첨가는 비지의 초기수분함량을 낮추면서, 고초균 발효의 촉진을 통한 콩 펩타이드 및 혈전용해효소의 증가, 점질물 생산, 풍미 개선을 비롯하여 발효비지의 단백질 보강이 가능하였다.

• Food Science and Biotechnology
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• 제18권2호
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• pp.500-505
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• 2009

The fibrinolytic enzyme, subtilisin D5, was purified from the culture supernatant of the isolated Bacillus amyloliquefaciens DJ-5. The molecular weight of subtilisin D5 was estimated to be 30 kDa. Subtilisin D5 was optimally active at pH 10.0 and $45^{\circ}C$. Subtilisin D5 had high degrading activity for the A$\alpha$-chain of human fibrinogen and hydrolyzed the $B{\beta}$-chain slowly, but did not affect the $\gamma$-chain, indicating that it is an $\alpha$-fibrinogenase. Subtilisin D5 was completely inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride, indicating that it belongs to the serine protease. The specific activity (F/C, fibrinolytic/caseinolytic activity) of subtilisin D5 was 2.37 and 3.52 times higher than those of subtilisin BPN' and Carlsberg, respectively. Subtilisin D5 exhibited high specificity for Meo-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA (S-2586), a synthetic chromogenic substrate for chymotrypsin. The first 15 amino acid residues of the N-terminal sequence of subtilisin D5 are AQSVPYGISQIKAPA; this sequence is identical to that of subtilisin NAT and subtilisin E.

• 한국생명과학회:학술대회논문집
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• 한국생명과학회 2001년도 제32회 학술심포지움
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• pp.67-86
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• 2001

A strain producing strongly fibrinolytic enzyme was isolated from soil and was identified to be Bacillus subtilis by biochemical and physiological characterization. The optimal culture conditions for the production of fibrinolytic enzyme was determined to be 1.0% tryptone, 1.5% soluble starch, 0.5% Peptone, 0.5% NaCl, $(NH_{4})_{3}PO_4.3H_{2}O, and MgSO_{4}.7H_{2}O.$ Initial pH and temperature were pH 8.0 and $30^{\circ}C$ , respectively, The highest enzyme production was observed at 30 hours of cultivation at $30^{\circ}C$ The fibrinolytic enzyme was purified to homogeneity by DEAE Sephadex A-50 ion exchange column chromatography, 70% ammonium sulfate precipitation, Sephadex G-200 and G-75 gel filtration column chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was 28,000 as determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. A gene encoding the fibrinolytic enzyme was cloned into a plasmid vector pBluescript, transforming E.coli XL-1 Blue. The clone was able to degrade fibrin, This indicated that the gene could encode a fibrinolytic enzyme. The nucleotide sequence of the 2.7 kb insert was determined in both direction. One open reading frame composed of 1023 nucleotides was found to be a potential protein coding region. There was the putative Shine-Dalgano sequence and TATA box upstream of the open reading frame. The homology search data in the genome database showed that both the 2.7 kb insert and 1 kb open reading frame carried no significance in the nucleotide sequence of known fibrinolytic enzyme from Bacillus serovars. The recombinant cell harboring the novel gene involved in fibrinolysis was subjected to protein purification. The molecular mass of the purified fibrinolytic enzyme was determined to be 31864 Dalton, which was highly in accordance with the molecular mass(33 kDa) of the fibrinolytic gene deduced from the insert. The fibrinolytic enzyme was Purified 50.5 folds to homogeneity in overall yield of 10.7% by DEAE Sephadex A-50 ion exchange, 85% ammonium sulfate precipitation, Sephadex G-50, Superdex 75 HR FPLC gel filtration. In conclusion, a novel fibrinolytic gene from Bacillus subtilis was identified and characterized by cloning a genomic library of Bacillus subtilis into pBleuscript. For the soybean fermented by this strain, it is found that there increased assistant protein about 20% compared to the soybean not fermented and increased about 30% according to amino acid analysis and, in particular, essential amino acid increased about 40%. When keeping this fermented soybean powder at room temperature for about 70days, it showed very high stability maintaining almost perfect activity and, therefore, it gave us great suggestion its possibility of development as a new functional food.

• KSBB Journal
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• 제13권5호
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• pp.491-496
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• 1998

The production of fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis BK-17 was studied in the shake flask cultures. The important medium components studied include nitrogen source, carbon source and inorganic salts. The environmental conditions include initial pH, temperature, shaking speed and working volume. Among various N-sources, C-sources and inorganic salts tested, soybean flour, D-glucose and Na2HPO4 gave the best results, and their optimal concentrations were 1.5%, 0.5% and 0.05%, respectively. The optimal pH and temperature were 9.0 and 37$^{\circ}C$. With decreasing working volume in the range of 25∼100ml in the 250ml flask or increasing shaking speed in the range of 100∼300rpm, the enzyme production was greatly enhanced. The enzyme activity under the optimal conditions was about 1400I.U./ml with urokinase as a standard.

• KSBB Journal
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• 제21권1호
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• pp.20-27
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• 2006

미생물 및 동물에 비해 식물에서는 혈전용해효소에 대한 연구가 부족한 실정이며, 기존의 혈전용해효소가 가지는 혈전에 대한 비특이적, 부작용, 고가 등의 단점을 해결할 수 있는 새로운 혈전용해효소의 개발을 위하여 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 추출된 수용성 단백질의 혈전용해 활성을 조사하였다. 각각의 식물들로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin 평판법으로 확인한 결과 피브린 응집을 효과적으로 분해하였다. 그 중 율무종자의 수용성 추출물의 혈전용해 활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.3배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 50-75% 에탄올을 이용하여 농축하였으며 율무의 혈전용해효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하고 직접 추출하였다. SDS-PAGE에 의하여 추출효소의 분자량을 측정한 결과 7.8 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 효소 활성에 미치는 온도의 효과는 $50^{\circ}C$ 이상에서는 비교적 안정하였으나 더 낮은 온도에서는 급격히 효소활성이 감소하였다. 또한, 각종 단백질분해효소 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 APMSF, PMSF, pepstatin A 그리고 TPCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 추출효소는 chymotrypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다. 그러나 EGTA와 EDTA 처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않았다. 더욱이, 종자저장 중에 미생물에 의한 부패, 활력저하, 생리활성물질의 감소와 장기저장에 따른 에너지소비 증가 등이 문제가 되고 있어 저선량의 감마선 조사를 통해 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 혈전용해 효소활성에 미치는 효과 및 선량에 따른 차이를 조사하였는데 비조사 종자인 대조구와 비교하여 1 Gy, 4 Gy, 16 Gy, 32 Gy선량에서는 낮은 활성을 보였으면 반면에 8 Gy와 64 Gy의 선량에서는 더 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 Y선 조사가 종자의 혈전용해 활성을 향상시킬 가능성이 있을 것으로 생각된다. 이상의 모든 결과로 볼 때 율무의 추출 효소는 chymotrypsin-like serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제17권5호
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• pp.606-612
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• 2007

혈전(fibrin clot)은 심혈관계 질환을 일으키는 주요 인자로서 전신의 미세동맥이나 모세혈관 내에서 형성되어 주의 조직이나 장기에 혈류의 공급방해가 생겨 허혈, 경색, 나아가 괴사까지도 발생시킨다. 혈전이 원인이 되어 발생한 심혈관계 질환을 예방 혹은 치료할 목적으로 기존으로 사용되고 있는 항혈전제(antithrombolytic drug)나 혈전용해제(thrombolytic drug)의 개발을 위해 많은 연구들이 진행되고 있다. 본 연구에서는 치료목적으로 사용할 혈전용해제를 분리하고자 Protaetia brevitarsis의 maggot로부터 ammonium sulfate 분획과 desalting column을 이용하여 fibrinolytic protease를 분리하고 생화학적 특성을 조사하였다. 활성의 최적 pH는 9.0였고 최적온도는 $50^{\circ}C$였다. pH 7.0-9.0 사이와 온도 $60^{\circ}C$이하에서는 비교적 활성이 안정성을 나타냈다. 효소활성이 phenylmethanesulfonyl fluoride에 의해 강하게 저해되고 있는 것으로 보아 serine protease로 추정되며 금속이온에 의한 영향을 조사해 본 결과 $Ca^{2+}$과 $Zn^{2+}$에 의해서는 저해되지만 $Mg^{2+}$와 $Fe^{2+}$에 의해서는 저해를 받지 않았다.

• 미생물학회지
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• 제34권3호
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• pp.87-90
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• 1998

우리 나라의 전통 대두발효식품인 된장으로부터 혈전용해능을 가진 미생물을 분리하였다. 그 중 5종류의 균주를 Bergey's manual of systematic bacteriology에 의거하여 동정한 결과 Bacillus sp. 균주로 밝혀졌다. 분리된 Bacillus 속 미생물을 효소 유도배지에서 배양한 결과 B. amyloliquefaciens는 2.46 plasmin unit/ml, B pantothenticus는 3.82 plasmin unit/ml 의 혈전용해능을 가지고 있었고, B. subtilis는 4.94 plasmin unti/ml의 높은 혈전용해효소 생산능을 보여주었다. 분리 균주에 의하여 생산된 세포외 단백질을 SDS-PAGE와 reverse fibrin zymogram 활성측정법에 의해 확인한 결과 각 균주별로 서로 다른 혈전용해효소가 생산되었음을 확인하였다.