• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제26권8호
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• pp.1398-1403
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• 2016

The simultaneous detection and accurate identification of hepatitis A virus (HAV) is critical in food safety and epidemiological studies to prevent the spread of HAV outbreaks. Towards this goal, a one-step duplex reverse-transcription (RT)-PCR method was developed targeting the VP1/P2B and VP3/VP1 regions of the HAV genome for the qualitative detection of HAV. An HAV RT-qPCR standard curve was produced for the quantification of HAV RNA. The detection limit of the duplex RT-PCR method was 2.8 × 10¹ copies of HAV. The PCR products enabled HAV genotyping analysis through DNA sequencing, which can be applied for epidemiological investigations. The ability of this duplex RT-PCR method to detect HAV was evaluated with HAV-spiked samples of fresh lettuce, frozen strawberries, and oysters. The limit of detection of the one-step duplex RT-PCR for each food model was 9.4 × 10² copies/20 g fresh lettuce, 9.7 × 10³ copies/20 g frozen strawberries, and 4.1 × 10³ copies/1.5 g oysters. Use of a one-step duplex RT-PCR method has advantages such as shorter time, decreased cost, and decreased labor owing to the single amplification reaction instead of four amplifications necessary for nested RT-PCR.

• The Plant Pathology Journal
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• 제30권4호
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• pp.445-449
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• 2014

The incidence of Cherry necrotic rusty mottle virus (CNRMV) and Cherry green ring mottle virus (CGRMV) have recently been occurred in Korea, posing a problem for sweet cherry cultivation. Since infected trees have symptomless leaves or ring-like spots on the pericarp, it is difficult to identify a viral infection. In this study, the incidence of CNRMV and CGRMV in sweet cherry in Gyeongbuk province was surveyed using a newly developed duplex reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) method that can detect both viruses in a single reaction. CNRMV and CGRMV co-infection rates were 29.6%, 53.6%, and 17.6%, respectively, in samples collected from three different sites (Daegu, Gyeongju and Gyeongsan) in Gyeongbuk province during 2012 and 2013. This duplex RT-PCR method offers a simple, rapid, and effective way of identifying CNRMV and CGRMV simultaneously in sweet cherry trees, which can aid in the management of viral infections that could undermine yield.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제23권5호
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• pp.630-636
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• 2013

Recently, there has been a growing body of evidence showing that cellular microRNAs (miRNAs) are involved in virus-host interactions. Numerous studies have focused on analyses of the expression profiles of cellular miRNAs, but the expression patterns of Dicer, which is responsible for the generation of miRNAs, have only rarely been explored in Gallus gallus. We developed a duplex real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for the relative quantification of the mRNAs of Dicer and ${\beta}$-actin in G. gallus. To apply this method, the expression of Dicer in avian cells after infection with avian leukosis virus subgroup J (ALV-J) was detected using our established duplex real-time RT-PCR. The duplex real-time RT-PCR assay is sufficiently sensitive, specific, accurate, reproducible, and cost-effective for the detection of Dicer in G. gallus. Furthermore, this study, for the first time, demonstrated that ALV-J can induce differential expression of Dicer mRNA in the ALV-J-infected cells.

• 한국가금학회지
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• 제44권2호
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• pp.93-102
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• 2017

본 연구에서 NDV의 L유전자와 F유전자를 표적 부위로 각각 제작한 primer 세트를 사용함으로써 하나의 PCR 튜브에서 NDV 검출(386 bp의 증폭 크기)과 함께 병원성 NDV(229 bp의 증폭 크기)를 동시에 감별 증폭할 수 있는 dRT-PCR 검사법을 개발하였다. 개발된 dRT-PCR검사법은 NDV를 특이적으로 검출하고, 병원성을 감별하였다. 특히 국내 병성감정 실시기관에서 적용 중인 기존의 RT-PCR 상용키트에서는 검출하지 못하는 class I NDV과 PPMV(class II 유전형 VI형)을 NDV를 검출함과 동시에 병원성 NDV도 감별가능하였다. 개발된 dRT-PCR 검사법의 검출 민감도는 약 $10^{3.0}EID_{50}/0.1mL$로 평가되었다. 또한 ND발생국의 야외 시료에 적용했을 때, NDV 공통항원 검출율은 94.4%였으며, 병원성 NDV 검출율은 100%이었다. 그러므로 본 연구에서 개발한 dRT-PCR 검사법은 의심축 사례에서 ND를 신속 정확하게 진단하는 데 유용할 진단 방법을 제공할 수 있을 것으로 판단된다.

• 식물병연구
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• 제15권2호
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• pp.57-62
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• 2009

우리나라 벼에 발생하는 주요 바이러스 중 애멸구에 의하여 전염하는 벼줄무의잎마름병(RSV)과 벼검은줄오갈병(RBSDV)에 대한 간편한 유전자 진단법인 VCHT-PCR 방법을 개발하였다. 벼 잎의 경우 즙액 추출 완충액은 0.5% sodium sulfite를 첨가한 0.01 M 인산완충액(pH 7.0)을 기본 완충액으로 이용하고 애멸구를 진단할 경우에는 기본 완충액에 2% PVP을 첨가하였을 때 VC/RT-PCR 진단이 잘 되었다. VC/RT-PCR을 이용한 진단에 적합한 RSV와 RBSDV 프라이머를 선발하였고 이것을 이용하여 동시진단으로 경기도 김포, 평택, 시흥지역에서 채집한 애멸구의 RSV와 RBSDV의 보독충을 쉽고 경제적으로 진단 할 수 있었다. ELISA에 의한 진단결과와 비교할 때 세 지역을 합하여 RSV에 대한 평균 보독충률은 9.2%로 동일하였으나 보독충 중 일부가 ELISA와 VC/RT-PCR 두 방법에 의한 진단결과가 다르게 나온 것은 RSV의 혈청학적, 유전적 계통 존재 가능성을 제시하고 있다. 포장에서 채집한 애멸구의 VC/RT-PCR 진단효율은 RSV와 RBSDV를 동시에 진단하므로 써 RSV만 진단이 가능한 ELISA 결과 보다 3.2% 높았다.

• 식물병연구
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• 제24권4호
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• pp.348-352
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• 2018

A multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction (mRT-PCR) assay was developed for the detection of Clover yellow vein virus (ClYVV), Peanut mottle virus (PeMoV), and Tomato spotted wilt virus (TSWV), which were recently reported to infect soybean and azuki bean in Korea. Species-specific primer sets were designed for the detection of each virus, and their specificity and sensitivity were tested using mixed primer sets. From among the designed primer sets, two combinations were selected and further evaluated to estimate the detection limits of uniplex, duplex, and multiplex RT-PCR. The multiplex RT-PCR assay could be a useful tool for the field survey of plant viruses and the rapid detection of ClYVV, PeMoV, and TSWV in leguminous plants.

• 한국임상수의학회지
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• 제23권3호
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• pp.300-307
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• 2006

In the present study, methods of the reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) were evaluated for the rapid detection and differentiation of transmissible gastroenteritis virus(TGEV), porcine epidemic diarrhea virus(PEDV) and rotavirus in piglets suffering from diarrhea. For the purposes, the PCR conditions were first confirmed for the amplification of VP7 gene of rotavirus and N gene of TGEV and PEDV using each specific primers and their annealing temperature. Multiplex RT-PCR methods were further determined to distinguish these viral infections and the results are as follows. For the specific amplification of these viral genes, the reliable PCR condition was determined as 30 cycles of reaction consisting each 1 min of denature at $94^{\circ}C$, annealing at $42^{\circ}C$ and polymerization at $72^{\circ}C$ with 1.0 mM $MgCl_2$. It was able to differentiate these viral infections in the intestines and feces of piglets suffering from diarrhea by duplex PCR for TGEV and PEDV and single PCR for rotavirus with a primer-annealing temperature of $42^{\circ}C$. When the multiplex RT-PCR were undertaken for the field samples, 17 cases of PEDV and 5 cases of rotavirus infections were differential diagnosed in a total of 92 samples of intestines and feces of the piglets with diarrhea.

• 생명과학회지
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• 제29권6호
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• pp.653-661
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• 2019

본 연구는 siRNA 기반 치료제등의 핵산치료제 개발에 있어서 필수적인 약물의 생체내 흡수, 분포, 대사, 배설에 대한 동태의 확인을 위해 stem-loop RT-qPCR 법을 이용하여 보다 더 정확한 시험법을 확립하고자 하였다. siRNA에 특이적인 primer와 probe를 선별하여 siRNA 정량검출 시험법을 최적화하였다. siRNA 표준시료를 이용하여 최적화된 시험법을 적용하였을 때 siRNA 표준시료에 대한 Cp 값(y)간의 선형분석 결과, 기울기 평균 -3.3, 결정계수 $R^2$>0.99으로 확인되어 siRNA 표준시료와 Cp 값 간의 회귀성이 매우 높아 정량 분석이 가능한 시험법임을 확인하였고, 같은 표준시료를 이용한 stem-loop RT-qPCR의 검출한계(LOD)는 10 fM, 최소정량한계(LLOQ)는 100 fM이었다. 확립된 시험법의 신뢰성을 확인하기 위해 시험자를 다르게 하고, 시험법을 3회 반복하여 각각 진행한 결과, siRNA 표준시료에 대한 Cp 값(y)간의 선형분석 결과 기울기와 결정계수 $R^2$의 재현성(slope ${\pm}-3.2$, 결정계수 $R^2$>0.99)을 확인하였고, 표준 곡선으로부터 환산된 siRNA 표준시료의 회수율(recovery ${\pm}20%$)과 완건성이 우수함을 확인하였다. 확립된 stem-loop RT-qPCR을 생체내 존재하는 약물 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 시험동물에 siRNA를 주입 후 시간별 혈액을 채취하여 확립된 시험법으로 시험을 진행하였고 약물 동태학적 분석을 통해 siRNA치료제의 혈액내의 안정성을 확인하였다. 따라서 본연구에서 개발된 stem-loop RT-qPCR 분석법은 정확성, 정밀성 및 민감도가 높은 분석법으로 핵산치료제 개발 연구의 다양한 생체시료 분석 연구에 적용할 수 있을 것으로 기대한다.