• 한국미생물·생명공학회지
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• 제15권5호
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• pp.352-355
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• 1987

새로운 제한효소인 Cth I을 Clostridium thermocellum ATCC 27405로부터 분리하여, 그 효소의 생화학적 특성을 연구하였다. 이 효소는 Bcl I endonuclease의 isoschizomer로서 5'-TGATCA-3'를 인식한다. Cth I endonuclease는 섭씨 60도의 높은 온도에서 잘 작용하며, 10mM까지의 저농도의 NaCl과 MG$^{2+}$ 이온의 존재하에서 pH7.5와 10.5사이에서 최적의 활성을 보여주었다. Cth I endonuclease의 활성은 DNA 기질이 dam methylation 되었을 때 저해를 받았다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제31권4호
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• pp.227-233
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• 2007

This study was conducted to examine the mRNA expression of apoptosis-related and imprinted genes and methylation pattern of the differentially methylated region (DMR) of H19 gene in day 35 of SCNT pig fetuses. The day 35 of natural mating (control) or cloned (clone) pig fetuses were recovered from uterus. Endometrium from dam and liver from fetus were obtained, respectively. mRNA expression was evaluated by real-time PCR and methylation pattern was analyzed by bisulfite sequencing method. The Bcl-2 mRNA expression in clone was significantly lower than that of control (p<0.05). The mRNA expression of H19 gene in both endometrium and liver was significantly higher in clone than that of control, respectively (p<0.05). The level of IGF-2 mRNA in liver of clone was significantly lower than that of control (p<0.05), whereas the mRNA expression of IGF2-R gene in liver of clone was significantly higher than that of control (p<0.05). The DMR of H19 was lower methylation pattern in clone than that of control. These results suggest that the aberrant mRNA expression of apoptosis-related and imprinted genes and the lower DMR methylation pattern of imprinted gene may be closely related to the inadequate fetal development of cloned fetus.

• 미생물학회지
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• 제55권2호
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• pp.103-111
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• 2019

DNA 메틸화는 유전체의 무결성의 유지 및 유전자 발현 조절과 같은 박테리아의 다양한 과정에 관여한다. Alphaproteobacteria 종에서 보존된 DNA 메틸 전이 효소인 CcrM은 S-아데노실 메티오닌을 공동 기질로 사용하여 $N^6$-아데닌 또는 $N^4$-시토신의 메틸 전이 효소 활성을 갖는다. Celeribacter marinus IMCC 12053는 해양 환경에서 분리된 알파프로테오박테리아로서 GpC 시토신의 외향고리 아민의 메틸기를 대체하여 $N^4$-메틸 시토신을 생산한다. 단일 분자 실시간 서열 분석법(SMRT)을 사용하여, C. marinus IMCC12053의 메틸화 패턴을 Gibbs Motif Sampler 프로그램을 사용하여 확인하였다. 5'-GANTC-3'의 $N^6$-메틸 아데노신과 5'-GpC-3'의 $N^4$-메틸 시토신을 확인하였다. 발현된 DNA 메틸전이 효소는 계통 발생 분석법을 사용하여 선택하여 pQE30 벡터에 클로닝 후 $dam^-/dcm^-$ 대장균을 사용하여 클로닝된 DNA 메틸라아제의 메틸화 활성을 확인하였다. 메틸화 효소를 코딩하는 게놈 DNA 및 플라스미드를 추출하고 메틸화에 민감한 제한 효소로 절단하여 메틸화 활성을 확인하였다. 염색체와 메틸라아제를 코드하는 플라스미드를 메틸화시켰을 때에 제한 효소 사이트가 보호되는 것으로 관찰되었다. 본 연구에서는 분자 생물학 및 후성유전학을 위한 새로운 유형의 GpC 메틸화 효소의 잠재적 활용을 위한 외향고리 DNA 메틸라제의 특성을 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제32권3호
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• pp.208-214
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• 1994

토양으로부터 분리한 방선균주로부터 새로운 type II 제한효소를 분리하여 그 특성을 연구하였다. 이 균주는 수리분석 결과, Streptoverticillium olivoverticillatum으로 동정되었으며, 정제한 제한효소는 SolI이라 명명하였다. SoII은 BamHI의 isoschizomer로서 여섯 개의 염기서열 5'-G $\downarrow$ GATCC- 3'을 인지하며 두 개의 G 염기 사이에서 절단하여 4 base가 돌출된 5'말단을 생성한다. 그러나 BamHI과는 달리, dam methylation 되어 있는 인식 염기서열에는 작용하지 못하였다. Ammonium sulfate 분획(30-65%)과 heparin-agarose, Affi-gel Blue column chromatography를 거쳐 SolI을 부분 정제하였다. SolI은 활성을 보이기 위하여 0.2mM 이상의 $MgCl_2$를 반드시 필요로 하였으며, 다른 cofactor는 요구하지 않았다. NaCl이 없을 때 가장 높은 활성을 가지며 120 mM 이상의 NaCl이 있으면 활성이 완전히 억제되었다. 이 효소의 반응 최적 온도는 $40^{\circ}C$, 최적 pH는 8.6으로 나타났다. Gel filtration chromatography에서의 용출부피 비교로부터 이 효소의 분자량은 약 43,000Da인 것으로 추정된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권9호
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• pp.1279-1287
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• 2012

We established an efficient transformation method for thermophile Geobacillus kaustophilus HTA426 using conjugative transfer from Escherichia coli of host-mimicking plasmids that imitate DNA methylation of strain HTA426 to circumvent its DNA restriction barriers. Two conjugative plasmids, pSTE33T and pUCG18T, capable of shuttling between E. coli and Geobacillus spp., were constructed. The plasmids were first introduced into E. coli BR408, which expressed one inherent DNA methylase gene (dam) and two heterologous methylase genes from strain HTA426 (GK1380-GK1381 and GK0343-GK0344). The plasmids were then directly transferred from E. coli cells to strain HTA426 by conjugative transfer using pUB307 or pRK2013 as a helper plasmid. pUCG18T was introduced very efficiently (transfer efficiency, $10^{-5}-10^{-3}\;recipient^{-1}$). pSTE33T showed lower efficiency ($10^{-7}-10^{-6}\;recipient^{-1}$) but had a high copy number and high segregational stability. Methylase genes in the donor substantially affected the transfer efficiency, demonstrating that the host-mimicking strategy contributes to efficient transformation. The transformation method, along with the two distinguishing plasmids, increases the potential of G. kaustophilus HTA426 as a thermophilic host to be used in various applications and as a model for biological studies of this genus. Our results also demonstrate that conjugative transfer is a promising approach for introducing exogenous DNA into thermophiles.