• Fisheries and Aquatic Sciences
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• 제15권1호
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• pp.77-81
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• 2012

We assessed the toxicity of cryoprotectant agents (CPAs) to gametophytic thalli of red alga Porphyra yezoensis at room temperature. The CPAs used were: dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), glycerol (GC), 1,2-butanediol (1,2-BD), 1,3-butanediol (1,3-BD), 2,3-butanediol (2,3-BD), 1,3-propanediol (1,3-PD) and propylene glycol (PG). CPA concentrations of 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, and 50% were employed with 30 or 60 s immersion. The toxicity of the eight CPAs to gametophytic thalli of P. yezoensis was in the order: 1,3-BD < DMSO ${\approx}$ 2,3-BD ${\approx}$ PG ${\approx}$ EG < GC < 1,3-PD ${\approx}$ 1,2-BD. All thalli were more sensitive to high CPA concentrations, and most (>75%) thalli survived exposure to 10-25% CPA for 60 s. These data will facilitate selection of the optimal cryoprotectant concentration for cryopreservation of P. yezoensis thalli.

• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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• pp.72-72
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• 2003

The present study examined the possibility of cryopreservation of the D-shaped and umbo larvae of arkshell (Scapharca broughtonii), in terms of the survival rates after freezing and thawing. D-shaped and umbo larvae of arkshells were obtained from a shellfish farming on Yosu city. The average shell lengths were $93.3 \pm 10.1 \mu$m and $201.7 \pm 13.5 \mu$, respectively. Five cryoprotectants (CPAs), dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG), and methanol, were tested at the concentrations of 1.5, 2.0 and 2.5 M. After larvae suspended in CPAs, cryoprotectants were loaded in 0.5 ml straws at a larval density of 50-100 larvae per straw, and epuilibrated for 10 and 20 minute at room temperature ($23^{\circ}C$), repectively. Straws were cooled at a rate of $1^{\circ}C$/min from $0^{\circ}C$ to $-12^{\circ}C$, held for 5 min at $-12^{\circ}C$, and then cooled at $2^{\circ}C$/min to $-35^{\circ}C$ and equilibrated for 5 min followed by plunging in liquid nitrogen. After storage in liquid nitrogen for 1 day, straws were thawed in a $30^{\circ}C$ water. As soon as straws were observed to melt, larvae were diluted with an equal volume of ASW and then washed twice with a large volume of ASW at an interval of 2 min to unload the CPAs. The results showed that after equilibration for 10 and 20 minute at room temperature, no larvae survived using methanol as CPAs, and it was observed that larval shells all open slightly, and larval flesh broke down and slopped over the shells. The highest survival rates (D-shaped larvae: 77.6%, umbo larvae: 59.3%) were obtained with 2M DMSO, and 1.5M glycerol yielded survival rates of 53.8% for D-shaped larvae and 37.5% for umbo larvae. The surviving D-shaped larvae showed active rotary motion and perfect membrane integrity and cytoplasmic normality, and the vigorous movement of veliger cilia was observed inside the closed shells. The breakdown of tissue occurred in the abnormal larvae, and the isolated cell often run out of shells.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제45권4호
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• pp.400-408
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• 2018

21세기 들어 전 세계는 환경파괴에 따른 지구 온난화로 인하여 생물 다양성이 지속적으로 감소하였다. 생물다양성의 감소는 생태계의 자정 및 복원능력 등을 악화 시켜 환경오염이 더욱 심화 되었고 나아가 생물의 생존을 위협하고 있다. 우리나라는 현재 나고야 의정서로 인해 국내 유전자원을 효율적으로 발굴 보호해야 하는 중요한 시점에 있다. 본 연구에서 사용하는 미세조류는 유용 생물자원으로 활용도가 높으나 동결보존하는 방법이 개발되어 있지 않아 장기보존에 어려움이 있다. 대부분의 원핵생물이나 균류 등의 미생물은 종에 관계없이 glycerol 을 이용하여 저온동결보존이 가능하나 미세조류는 동결보존제의 종류와 농도, 유리화 과정 및 해동방법 등에 따라 세포 재생률에 차이가 있기 때문에 구체적인 연구가 필요하다. 미세조류 중 규조류는 전 세계적으로 발견되며 규산질로 구성된 cell wall 은 이미 산업적으로 많이 이용되고 있다. 본 연구에서는 해양 규조류 Nizschia frustulum과 Nitzschia amabilis를 이용하여 장기 동결보존을 위한 기초연구를 수행하였다. 동결보존제로는 세포막 침투성 보존제인 glycerol, DMSO, methanol을 각각 5, 10, 15% 농도로 제조하여 실험하였고 메탄올의 경우 시약 특성상 5, 10, 12% 농도로 실험하였으며 미세조류는 N. frustulum과 N. amabilis 두 종을 각각 $10^2$, $10^3$, $10^4cells\;ml^{-1}$로 희석하여 사용하였다. 실험에 사용한 미세조류 두 종 모두 메탄올 12%에서 가장 높은 생존율을 보였으며 N. frustulum은 $6.94{\pm}0.31%$, N. amabilis는 $8.85{\pm}0.16%$로 나타났다. 동결 후 해동한 미세조류를 3주간 재배양한 결과에서는 N. frustulum이 재배양 초기 농도보다 약10배 증가하였고 N. amabilis는 약12배 증가한 결과를 나타내었다. 본 연구에서는 유용생물자원인 미세조류 Nizschia sp.에 한하여 적합한 동결보존제를 탐색하였으며 이 자료를 바탕으로 더 많은 동결보존제에 대한 효과와 다양한 미세조류 종에 적합한 동결보존 기법 연구가 필요한 것으로 사료된다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제22권3호
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• pp.328-335
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• 2009

This study was undertaken to investigate the influence of exposure and removal of four different cryoprotectants (CPAs) on the ATP content of cumulus cell-enclosed (COs) and cumulus cell-denuded (DOs) immature porcine oocytes. The in vitro nuclear maturation of the COs, exposed to and removed from the CPAs was also assessed. Both COs and DOs were exposed to 1.5 M concentrations of each CPA (ethylene glycol (EG); propylene glycol (PG); dimethyl-sulfoxide (DMSO); and glycerol (G)) for durations of 5, 15, and 30 minutes at room temperature ($23.5{\pm}1.5^{\circ}C$), and immersed in physiological saline supplemented with 20% (v/v) fetal bovine serum for 5 minutes ($39^{\circ}C$) to remove each CPA. Before, during and after exposure to each CPA, the ATP content of both the COs and the DOs was measured. After removal from each CPA an aliquot of the COs was matured for 44${\pm}$2 h, and their nuclear maturation rates were measured up to the metaphase stage of the second meiotic division (the M-II stage). The maturation rates up to the M-II stage were not significantly different between all the groups that were exposed to each CPA for 5 minutes. For 15 and 30 minute exposures, the maturation rates of the COs exposed to PG, DMSO and EG were almost the same as those of the control groups; however, the rates of G group exposed for 15 and 30 minutes were significantly lower (p<0.05) than the control group. These groups were also found to have a decrease in the ATP content of COs and DOs during and after exposure for the same periods (p<0.05). In addition, although the ATP contents of the COs after exposure to EG for any period were the same as the controls, the ATP content of the DOs exposed to EG for any period were significantly lower (p<0.05) than those of the controls. When the ATP content of the COs and DOs of each CPA were compared, the DOs exposed to PG were found to have a significantly greater level (p<0.05) than DOs exposed to G for any duration. In addition, the ATP content of DOs exposed to PG for 30 min and removal was also higher (p<0.05) than when exposed to DMSO for the same period. These findings indicate that PG may be a useful CPA for the cryopreservation of immature porcine oocytes.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제38권1호
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• pp.24-30
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• 2011

Objective: The objectives of this study were to analyze efficacy of immature and mature mouse oocytes after vitrification and warming by applying various combinations of cryoprotectants (CPAs) and/or super-rapid cooling using slush nitrogen ($SN_2$). Methods: Four-week old ICR female mice were superovulated for GV- and MII-stage oocytes. Experimental groups were divided into two groups. Ethylene glycol (EG) only group: pre-equilibrated with 1.5 M EG for 2.5 minutes and then equilibrated with 5.5 M EG and 1.0 M sucrose for 20 seconds. EG+dimethylsulfoxide (DMSO) group: pre-equilibrated with 1.3 M EG+1.1 M DMSO for 2.5 minutes and equilibrated with 2.7 M EG+2.1 M DMSO+0.5 M sucrose for 20 seconds. The oocytes were loaded onto grids and plunged into $SN_2$or liquid nitrogen ($LN_2$). Stored oocytes were warmed by a five-step method, and then their survival, maturation, cleavage, and developmental rates were observed. Results: The EG only and EG+DMSO groups showed no significant difference in survival of immature oocytes vitrified after warming. However, maturation and cleavage rates after conventional insemination were greater in the EG only group than in the EG+DMSO group. In mature oocytes, survival, cleavage, and blastocyst formation rates after warming showed no significant difference when EG only or EG+DMSO was applied. Furthermore, cleavage and blastocyst formation rates of MII oocytes vitrified using $SN_2$ were increased in both the EG only and EG+DMSO groups. Conclusion: A combination of CPAs in oocyte cryopreservation could be formulated according to the oocyte stage. In addition, $SN_2$ may improve the efficiency of vitrification by reducing cryoinjury.

• 융합정보논문지
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• 제11권1호
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• pp.128-135
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• 2021

바지락 발생배의 냉동보존을 위한 동해방지제의 효과를 규명하기 위하여4종의 보존액, dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, glycerol 및 1,2-propanediol을 사용하여 발생배의 생존율을 조사한 결과로, 생존율의 범위는 0-64.3%였고, 대조구의 생존율은 82.3%을 보였다. 발생배의 냉동보존을 위한 프로그래 동결 과정은 최초 25℃에서 10분 동안 유지하다가 자동 냉동보존 프로그램 장치에 의하여 -12℃까지 분당 -1℃씩 조정하였으며 -35℃까지는 분당 -2℃씩 하강시켜 액체 질소통에 스트로우를 넣어 해동 후 관찰한 결과, 바지락 생존율은 DMSO(dimethyl sulfoxide) 2.0M 실험구에서 64.3%로 가장 좋은 결과를 보였다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제37권4호
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• pp.307-319
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• 2010

목적: 유리화 동결액의 조성조절과 냉각속도 증진을 통한 동결보호제의 농도를 낮추는 전략을 통해 세포에 미치는 독성을 감소시켜 유리화 동결 및 융해 후 생쥐 배아의 생존율 및 발생률을 증진시키고, 궁극적으로 배아의 유리화 동결법을 개선하고자 하였다. 연구방법: 생쥐 배아와 포배기를 그리드를 이용한 유리화 동결법을 이용하여 동결/융해하였다. 동결액 내 ethylene glycol와 dimethylsulphoxide (DMSO)의 농도와 당의 농도를 조절하여 생쥐 배아의 융해 후 생존율과 발생률을 관찰하였고, 냉각속도의 증가와 동결억제제의 농도와의 상관관계를 포배기의 융해 후 생존율과 발생률에 따라 비교하였다. 또한 융해 후 배아를 대리모에 이식하여 산자를 생산함으로 냉각속도의 효율성을 알아보았다. 결과: EG를 단독으로 사용한 동결보존액 보다는 DMSO와 혼합된 동결보존액의 사용이 보다 유리하다는 결과를 얻을 수 있었다. 슬러시 질소에 의한 냉각속도의 증가가 동결보존의 대상의 상해를 줄여 유리화 동결의 효율성을 증진시키는 것으로 생각된다. 결론: 혼합된 동결보호제를 사용하였을 때 생쥐 배아의 유리화 동결 후 생존과 발생률이 증진되었다. 슬러시 질소를 이용한 유리화 동결의 도입은 냉각속도의 증가를 통해 기존 유리화 동결방법의 효율을 증진시켜 생존율과 융해후 발생률, 임신율 증진에 기여하였다. 또한 냉각속도의 증진은 유리화 동결의 필수요건인 고농도의 동결억제제에 대한 노출을 감소시킬 수 있었다. 이러한 노력은 생식력의 보전을 위한 유리화 동결법의 효율 향상에 기여할 것이다.

• 한국해양생명과학회지
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• 제8권2호
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• pp.115-120
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• 2023

본 연구는 동자개 정자의 동결보존을 위해 동결보존제의 최적 농도와 적정 희석액을 구명하여 정자를 최상의 상태로 보존하여 인공종자를 생산하는데 목적이 있다. 실험은 3종의 희석액(I: 300 mM glycose, II: Kurokura extender, III: Li extender), 4종의 동결보존제(dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, methanol and glycerol)와 4개의 동결보존제 농도(5, 10, 15, 20%)를 조합하여 대하여 조사하였다. 동결보존한 정자를 해동한 후 정자의 생존율과 정자활성지수로 동결보존제의 효과를 평가하였다. 희석액 III(Li extender)과 10과 15%의 methanol을 조합했을 때 동자개 정자의 생존율과 정자활성지수는 각각 66.9 ± 8.7, 67.3 ± 13.1%과 2.6 ± 0.4, 2.6 ± 0.5로 다른 희석액과 동결보존제보다 높았다.