• 제목/요약/키워드: cofactor

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출아효모에서 xylitol dehydrogenase (XYL2)의 최적 생산을 위한 발현 시스템 구축 (Expression System for Optimal Production of Xylitol Dehydrogenase (XYL2) in Saccharomyces cerevisiae)

  • 정회명;김연희
    • 생명과학회지
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    • 제27권12호
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    • pp.1403-1409
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    • 2017
  • 본 연구에서는 lignocellulosic biomass (xylose)의 부가가치를 높이고 효율적인 활용을 위해 xylitol dehydrogenase를 Saccharomyces cerevisiae 숙주세포에서 분비 생산하고자 하였다. 먼저 S. cerevisiae와 Pichia stipitis유래 XYL2 유전자(S.XYL2 and P.XYL2 gene)의 발현 시스템을 구축하기 위하여 GAL10 promoter와 ADH1 promoter 하류에 각각 mating factor ${\alpha}$ ($MF{\alpha}$) signal sequence와 XYL2유전자를 가진 $pGMF{\alpha}-S.XYL2$, $pGMF{\alpha}-P.XYL2$, $pAMF{\alpha}-S.XYL2$$pAMF{\alpha}-P.XYL2$ plasmid를 구축하였다. 각각의 plasmid는 S. cerevisiae $SEY2102{\Delta}trp1$ 균주에 형질전환되었고, 생산된 xylitol dehydrogenase의 활성을 조사해 본 결과, GAL10 promoter가 ADH1 promoter보다 XYL2유전자의 발현에 더욱 적합함을 확인 할 수 있었다. 또한 P. stipitis 유래의 xylitol dehydrogenase 효소 활성이 S. cerevisiae 유래의 효소 활성보다 2배 이상 더 높았으며, 활성의 증가를 위해 두 유전자 모두 cofactor로 $NAD^+$에 의존한다는 것을 확인하였다. 재조합 유전자가 가지는 분비서열에 의해 $SEY2102{\Delta}trp1/pGMF{\alpha}-P.XYL2$ 균주에서 xylitol dehydrogenase의 약 77%는 periplasmic space로 분비 발현되었음을 알 수 있었다. 또한 재조합 xylitol dehydrogenase의 효율적인 생산을 위해 탄소원의 영향을 조사해본 결과, glucose 단독보다 glucose와 xylose를 혼합 배양한 경우에서 효소활성이 최대 41% 정도 증가되었음을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 최적화한 발현 시스템 및 배양 조건은 xylose 뿐만 아니라 다양한 biomass를 이용한 유용물질 생산을 위한 관련 단백질의 발현 분비시스템 구축 및 대량생산에도 응용될 수 있을 것이라 생각된다.

신 바이오디젤 원료 작물인 Camelina의 cDNA library 제작 및 유전자 특성 (Construction and Characterization of a cDNA Library from the Camelina sativa L. as an Alternative Oil-Seed Crop)

  • 박원;장영석;안성주
    • 한국작물학회지
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    • 제55권2호
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    • pp.151-158
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    • 2010
  • 지금까지 양구슬냉이의 유전정보는 거의 연구되지 않았으므로 우리는 양구슬냉이의 잎으로부터 cDNA library를 제작하고 발현유전자의 종류와 기능별 분류를 조사하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. cDNA library에서 1334개 의 클론들을 얻었고 삽입된 단편들의 염기서열의 평균길이는 736bp였다. 우리는 1269개의 high-quality expressed sequence tags (ESTs) 서열을 얻었다. 이러한 EST의 클러스터 분석결과 고유 염기서열(unigene)을 가진 유전자의 수는 851개를 나타냈다. 2. Unigene 476개는 GeneBank에 기능이 알려진 유전자들과 고도의 상동성을 나타내었다. 다른 375개의 unigene들은 기능이 알려지지 않은 것들이었다. 나머지 63개는 NCBI데이터베이스에 어떤 유전자와도 상동성을 보이지 않았고 이러한 유전자들은 아마도 양구슬냉이의 잎에서 발현되는 새로운 유전자일 것으로 보인다. 3. 데이터베이스에서 상동성을 나타낸 EST들을 기능별 주석에 따라서 17개의 카테고리로 분류하였다. 대표적으로 가장 분포도가 높은 카테고리는 결합 기능 또는 보조인자 요구의 단백질(27%), 대사(11%), 세포 소기관 위치(11%), 세포수송과 수송기관 그리고 수송 경로(7%), 에너지(6%), 대사와 단백질 기능의 조절(6%) 등이 있다. 이러한 우리의 연구 결과는 양구슬냉이의 유용한 유전적 자원과 전반적인 mRNA 발현 정보를 제공해 줌으로써 대체 에너지 작물로 떠오르는 양구슬냉이의 다양한 분자적 연구에 기여할 것으로 사료된다.

페닐케톤뇨증의 치료: 현재와 미래 (Phenylketonuria: Current Treatments and Future Developments)

  • 이정호
    • 대한유전성대사질환학회지
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    • 제20권2호
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    • pp.37-43
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    • 2020
  • 페닐케톤뇨증(PKU)은 전세계적으로 가장 잘 알려지고 중요한 유전성 대사질환이다. 1950년대 이후 단백제한을 이용한 식사치료를 처음으로 시도하여 성과가 있었던 질환이며 1960년대 이후 신생아선별검사를 통해 조기진단과 조기치료가 가능하게 된 최초의 유전성대사질환이기 때문이다. 단백제한 식사치료의 효과가 좋지만 학동기, 사춘기 이후 성인시기까지 유지하는 것의 어려움이 있고 이시기에 조절이 잘 되지 않았을 경우 경련, 여러가지 정신과적인 문제들, 삶의 질의 감소 등이 문제가 되어서 오랜 기간 치료를 위한 여러 방법들이 제시되었다. 더해서 2014년 미국의학유전학회(American Medical College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)에서 전 연령에서 혈중 페닐알라닌 수치를 120-360 umol/L로 제시를 한 이후 더욱 치료의 중요성이 올라갔다. 2000년대 페닐알라닌수산화 효소(phenylalanine hydroxylase, PAH)의 조효소인 tetrahydrobiopterin (BH4)가 치료 승인되어서 약물반응을 보이는 환자에서 치료가 시작되었으며 4세미만에서도 허가가 되어서 이른 시기부터 약물치료를 병행하여 효과를 보게 되었다. 높은 혈중 페닐알라닌수치가 혈액-뇌 장벽(Blood-brain barrier, BBB)을 통하여 뇌로 넘어가서 회백질의 변성을 나타내게 되는 문제를 막기 위해 거대중성아미노산(LNAA)를 이용한 치료가 시도되고 있다. 오랫동안 연구되었던 페닐알라닌을 trans-cinnamic acid와 암모니아로 변화를 시키는 phenylalanine ammonialyase (PAL)을 이용한 효소치료는 최근 약제로 개발되어서 2018년 이후 성인환자를 대상으로 치료가 시작되었고 잘 조절되지 않는 환자들에게 효과를 보이고 있다. PAL을 경구용으로 개발하는 것이 빠르게 진행 중이며 유전자치료에 대한 연구들도 활발하게 진행이 되고 있어 다양한 치료들이 앞으로 기대된다.

흰쥐에서 L-carnitine 투여 후에 혈청 지방산과 Carnitine의 농도 변화 (Changes of Serum Fatty Acid and Carnitine Levels after Administration of L-carnitine in Rats)

  • 이재원;홍영미
    • Clinical and Experimental Pediatrics
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    • 제45권9호
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    • pp.1075-1082
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    • 2002
  • 목 적: L-carnitine은 carnitine acyltransferase 효소에 의해 장쇄(long chain)지방산을 세포질에서 미토콘드리아로 이동시킬 때 필요한 효소로 미토콘드리아 내로 이동된 장쇄 지방산은 ${\beta}$-산화를 거쳐 신체의 에너지원으로 사용된다. 비만 치료 방법의 하나로 L-carnitine을 투여하여 간과 근육세포의 산화를 증가시켜 혈청 지방을 감소시키려는 시도가 있으며, 실제로 L-carnitine이 혈청 지방산을 낮추는지를 알아보기 위해 본 연구를 실시하였다. 방 법: 250 g 내외의 Sprague Dawley 쥐를 두 군으로 나누어 실험하였다. A군은 정상 대조군, B군에서 L-carnitine을 200 mg/kg씩 매일 복강 내로 투여하였다. Hitachi 기기를 이용하여 총 콜레스테롤, 중성지방, 고분자량 콜레스테롤, 저분자량 콜레스테롤을 측정하였고, 혈청 C6-C18 지방산은 GC/MS 분석에 의해 1일, 1주, 2주에 측정하였다. Cycling 기법을 이용하여 총 carnitine, 유리 carnitine, 아실 carnitine을 정량 분석하였다. 결 과 : 1) 혈청 총 콜레스테롤, 고분자량 콜레스테롤, 저분자량 콜레스테롤은 두 군 사이에 유의한 차이가 없었으나, 중성지방은 1주일째에 A군은 $131.3{\pm}31.3mg/dL$인데 반하여 B군은 $90.0{\pm}7.0mg/dL$로 의미있는 감소를 보였다. 2) 혈청 총 지방산은 A군에 비해 B군에서 1주에만 약간의 감소를 보였으나 통계학적 유의성은 없었다. 1주일째 장쇄 지방산인 리놀레인 산(linoleic acid)이 B군에서 A군에 비해 유의하게 감소하였다. 3) L-carnitine투여 후 carnitine(total, free, acyl) 치는 1일째, 1주일째 및 2주일째에 모두 B군이 A군보다 유의하게 높았으나, 유리 carnitine 만이 투여 누적 용량에 따라서 유의한 증가를 보였다. 결 론 : L-carnitine 투여 후 1주일째에 혈중 중성 지방의 농도가 감소하였고, 리놀레인 산이 미토콘드리아 내로 이동함으로 혈중 농도의 감소를 보였다.

지역농산물의 비타민 K1 함량 조사 (A Study on Contents of Vitamin K1 in Local Agricultural Products)

  • 이아름;김주희;박재호;김영호;홍의연;김행란;최용민;이준수;엄현주
    • 한국식품영양학회지
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    • 제29권3호
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    • pp.301-306
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    • 2016
  • 본 연구는 국내에서 많이 재배되는 농산물과 특수하게 재배되는 농산식품 자원(잎 및 채소류 9종, 과일류 16종, 곡류 및 특용작물 11종)을 선정하여 비타민 $K_1$의 함량 분석하여 기초데이터를 마련하고, 실험에 사용한 분석법을 검증하여 결과의 신뢰도를 확보하고자 하였다. 각 식품군의 비타민 $K_1$은 용매추출법을 이용하여 추출하였고, 형광 검출기를 이용하여 HPLC를 통해 정량하였다. 잎채소류 내 비타민 $K_1$의 범위는 $107.03{\sim}682.73{\mu}g$/100 g였으며, 구기자 잎에서 $682.73{\mu}g$/100 g으로 가장 높게 검출되었고, 대왕토란과 고구마는 각각 $1.83{\mu}g$/100 g과 $2.72{\sim}2.74{\mu}g$/100 g으로 낮은 함량을 보였다. 과일류의 비타민 $K_1$ 함량 범위는 $0.17{\sim}28.22{\mu}g$/100 g으로 분석되었고, 마른 반시에서 $28.22{\mu}g$/100 g으로 가장 높은 수치를 보였으며, 청포도 $14.97{\mu}g$/100 g, 키위류 $13.54{\sim}16.36{\mu}g$/100 g으로 다른 과일들과 비교해서 비교적 높은 함량을 보였다. 곡류의 비타민 $K_1$ 함량 범위는 $1.14{\sim}3.47{\mu}g$/100 g이었고, 느타리버섯, 이슬송이버섯, 초석잠에서는 모두 비타민 $K_1$이 검출되지 않았다. 검량선의 상관계수는 0.999로 높은 유의 수준을 보여 분석에 적합함을 알 수 있었으며, 반복성과 재현성의 변동계수 값은 각각 8.95%, 5.28%로 우수하였다. 따라서, 본 연구에서 분석된 자료는 국내에서 재배되는 지역농산물의 비타민 $K_1$ 기초데이터로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

새로운 신경전달물질 H2S 발생 효소, cystathionine γ-lyase의 대량발현 조건과 활성측정 (Overexpression and Activity Analysis of Cystathionine γ-Lyase Responsible for the Biogenesis of H2S Neurotransmitter)

  • 김경란;변혜정;조현남;김정현;양선아;지광환
    • 생명과학회지
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    • 제21권1호
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    • pp.119-126
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    • 2011
  • 질병과 밀접한 관계가 있는 hCGL 단백질의 경우 대량 배양 시 유도체를 사용하지 않아도 발현이 되는 점과 유전자 측면에서 조작이 쉬운 E.coli를 이용하여도 발현이 된다는 점에 있어서 중요한 이점을 가지고 있다. 본 연구에서는 배양되는 온도와 발현에 관련 있는 유도체의 농도, 600 nm에서의 균 성장 정도에 따른 유도체의 첨가 그리고 배지의 양을 조절하면서 유입되는 aeration의 조건으로 hCGL 단백질 발현의 최적의 조건 확립을 목적으로 하였다. 또 각 발생되는 inclusion body의 양을 측정하면서 보다 많은 가용성 단백질을 발현시키는 조건을 확립하고자 하였다. hCGL 단백질은 저온에서 보다 많은 양의 단백질이 발현되며 inhibitor의 억제를 담당하는 유도체의 농도와는 상관없이 발현이 되었다. 또한 균의 성장 정도에 따라 유도체의 첨가시기를 달리 하였을 때, 발현 비율에 차이는 있었으나 전체적인 단백질 양과 비교해 보면, 이는 hCGL 발현에 큰 영향을 미치지 않는다. 배지의 양을 달리하여 살펴본 aeration에 따른 hCGL 발현 정도는 배지의 부피가 15%일 때 높은 aeration으로 균의 양은 많았으나 목적 단백질인 hCGL의 발현은 aeration이 되지 않는 조건에서 더 잘되는 것을 확인하였다. 그리고 His-TEV-hCGL의 활성은 야생형 hCGL의 활성을 기준으로 하였을 때, L-cystathionine을 기질로 하였을 경우 76%, L-cysteine을 기질로 하였을 경우 88% 수준으로 유사한 활성을 나타내었고, 이는 손쉽게 정제 가능한 His-TEV-hCGL을 야생형을 대신하여 사용할 수 있음을 시사한다. 또한 His-TEV-hCGL이 야생형 hCGL과 같이, 427 nm에서 흡광을 가지는 것으로 보아 보효소PLP를 포함하고 있음을 알 수 있었다. 이로써 homocysteine 대사연구에 필수적인 hCGL 효소를 다량 얻는 방법을 확립하고, 관련 연구에 기여하리라 사료된다.

쥐의 급식회수(給食回數)와 체지방과잉합성(體脂肪過剩合成) (Frequency of Meals and Hyperlipogenesis of Rat)

  • 한인규
    • Applied Biological Chemistry
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    • 제7권
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    • pp.21-27
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    • 1966
  • (1) 급식회수(給食回數)가 각종(各種) 영양소(營養素)의 대사과정(代謝過程)에 미치는 영향을 연구(硏究)하기 위하여 30 마리의 생후(生後) 80 일(日)이된 쥐(체중(體重) 290 gm)와 32 마리의 40 일(日)이된 쥐(체중(體重) 180 gm)로서 34 일간(日間) 실험(實驗)하였다. (2) 자유채식구(自由採食區)(1 일(日) $10{\sim}15$ 회채식(回採食))와 1 일(日) 2회급식구(回給食區)의 쥐를 pair feeding 시켰으며 양구(兩區)의 채식량(採食量)이 같도록 엄밀히 조절(調節)하였다. (3) 양구(兩區)보다 체중증가율(體重增加率)이 유사(類似)하였으나 1 일(日) 2회채식구(回採食區)가 지방(脂肪) Energy의 증가율(增加率)이 자유채식구(自由採食區)보다 현저히 높았으나 단백질(蛋白質)의 함량(含量)은 자유채식구(自由採食區)가 높았으며 광물질(鑛物質)의 함량(含量)은 양구(兩區)보다 유사(類似)하였다. (4) 1 일(日) 2회급식(回給食)하는 경우 탄수화물대사과정(炭水化物代謝過程)의 변화(變化)를 초래 하였다. 즉(卽) 이구(區)의 G-6-P dehydrogenase의 활성(活性)이 2배(倍)나 더 높은 것으로 보아 정상적(正常的)인 Glycolysis에서 HMPS로 전변(轉變)되었음이 판명(判明)되었고, 따라서 NADPH의 생산(生産)이 촉진(促進)되었고 또한 지방산(脂肪酸)의 합성(合成)이 촉진(促進)되었다. (5) 채식회수(採食回數)는 단백질(蛋白質)의 이용(利用) 및 대사(代謝)에도 영향을 주는바 1 일(日) 2회급식구(回給食區)는 체내단백질(體內蛋白質) 합성율(合成率)이 낮고 반면(反面)에 뇨(尿)로 유실(流失)되는 질소(窒素)의 량(量)은 많음이 밝혀졌다. deamination이 되고 또는 carbon skeletal은 지방합성전구물(脂肪合成前軀物)로 쓰이는듯 하다. (6) 채식회수(採食回數)는 내분비(內分泌)를 촉진 또는 억제하는바 1 일(日) 2회급식구(回給食區)의 경우 insulin의 분비(分泌)를 촉진하나 Thyroidal Hormone의 분비(分泌)를 억제하는듯 하다. 따라서 이구(區)의 Heat production이 자유채식구(自由採食區)보다 낮으며 더 많은 energy가 지방합성(脂肪合成)에 쓰여질 수 있게 되는듯 하다.

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Sesquiterpenoids Bioconversion Analysis by Wood Rot Fungi

  • Lee, Su-Yeon;Ryu, Sun-Hwa;Choi, In-Gyu;Kim, Myungkil
    • 한국균학회소식:학술대회논문집
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    • 한국균학회 2016년도 춘계학술대회 및 임시총회
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    • pp.19-20
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    • 2016
  • Sesquiterpenoids are defined as $C_{15}$ compounds derived from farnesyl pyrophosphate (FPP), and their complex structures are found in the tissue of many diverse plants (Degenhardt et al. 2009). FPP's long chain length and additional double bond enables its conversion to a huge range of mono-, di-, and tri-cyclic structures. A number of cyclic sesquiterpenes with alcohol, aldehyde, and ketone derivatives have key biological and medicinal properties (Fraga 1999). Fungi, such as the wood-rotting Polyporus brumalis, are excellent sources of pharmaceutically interesting natural products such as sesquiterpenoids. In this study, we investigated the biosynthesis of P. brumalis sesquiterpenoids on modified medium. Fungal suspensions of 11 white rot species were inoculated in modified medium containing $C_6H_{12}O_6$, $C_4H_{12}N_2O_6$, $KH_2PO_4$, $MgSO_4$, and $CaCl_2$ for 20 days. Cultivation was stopped by solvent extraction via separation of the mycelium. The metabolites were identified as follows: propionic acid (1), mevalonic acid lactone (2), ${\beta}$-eudesmane (3), and ${\beta}$-eudesmol (4), respectively (Figure 1). The main peaks of ${\beta}$-eudesmane and ${\beta}$-eudesmol, which were indicative of sesquiterpene structures, were consistently detected for 5, 7, 12, and 15 days These results demonstrated the existence of terpene metabolism in the mycelium of P. brumalis. Polyporus spp. are known to generate flavor components such as methyl 2,4-dihydroxy-3,6-dimethyl benzoate; 2-hydroxy-4-methoxy-6-methyl benzoic acid; 3-hydroxy-5-methyl phenol; and 3-methoxy-2,5-dimethyl phenol in submerged cultures (Hoffmann and Esser 1978). Drimanes of sesquiterpenes were reported as metabolites from P. arcularius and shown to exhibit antimicrobial activity against Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus (Fleck et al. 1996). The main metabolites of P. brumalis, ${\beta}$-Eudesmol and ${\beta}$-eudesmane, were categorized as eudesmane-type sesquiterpene structures. The eudesmane skeleton could be biosynthesized from FPP-derived IPP, and approximately 1,000 structures have been identified in plants as essential oils. The biosynthesis of eudesmol from P. brumalis may thus be an important tool for the production of useful natural compounds as presumed from its identified potent bioactivity in plants. Essential oils comprising eudesmane-type sesquiterpenoids have been previously and extensively researched (Wu et al. 2006). ${\beta}$-Eudesmol is a well-known and important eudesmane alcohol with an anticholinergic effect in the vascular endothelium (Tsuneki et al. 2005). Additionally, recent studies demonstrated that ${\beta}$-eudesmol acts as a channel blocker for nicotinic acetylcholine receptors at the neuromuscular junction, and it can inhibit angiogenesis in vitro and in vivo by blocking the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway (Seo et al. 2011). Variation of nutrients was conducted to determine an optimum condition for the biosynthesis of sesquiterpenes by P. brumalis. Genes encoding terpene synthases, which are crucial to the terpene synthesis pathway, generally respond to environmental factors such as pH, temperature, and available nutrients (Hoffmeister and Keller 2007, Yu and Keller 2005). Calvo et al. described the effect of major nutrients, carbon and nitrogen, on the synthesis of secondary metabolites (Calvo et al. 2002). P. brumalis did not prefer to synthesize sesquiterpenes under all growth conditions. Results of differences in metabolites observed in P. brumalis grown in PDB and modified medium highlighted the potential effect inorganic sources such as $C_4H_{12}N_2O_6$, $KH_2PO_4$, $MgSO_4$, and $CaCl_2$ on sesquiterpene synthesis. ${\beta}$-eudesmol was apparent during cultivation except for when P. brumalis was grown on $MgSO_4$-free medium. These results demonstrated that $MgSO_4$ can specifically control the biosynthesis of ${\beta}$-eudesmol. Magnesium has been reported as a cofactor that binds to sesquiterpene synthase (Agger et al. 2008). Specifically, the $Mg^{2+}$ ions bind to two conserved metal-binding motifs. These metal ions complex to the substrate pyrophosphate, thereby promoting the ionization of the leaving groups of FPP and resulting in the generation of a highly reactive allylic cation. Effect of magnesium source on the sesquiterpene biosynthesis was also identified via analysis of the concentration of total carbohydrates. Our current study offered further insight that fungal sesquiterpene biosynthesis can be controlled by nutrients. To profile the metabolites of P. brumalis, the cultures were extracted based on the growth curve. Despite metabolites produced during mycelia growth, there was difficulty in detecting significant changes in metabolite production, especially those at low concentrations. These compounds may be of interest in understanding their synthetic mechanisms in P. brumalis. The synthesis of terpene compounds began during the growth phase at day 9. Sesquiterpene synthesis occurred after growth was complete. At day 9, drimenol, farnesol, and mevalonic lactone (or mevalonic acid lactone) were identified. Mevalonic acid lactone is the precursor of the mevalonic pathway, and particularly, it is a precursor for a number of biologically important lipids, including cholesterol hormones (Buckley et al. 2002). Farnesol is the precursor of sesquiterpenoids. Drimenol compounds, bi-cyclic-sesquiterpene alcohols, can be synthesized from trans-trans farnesol via cyclization and rearrangement (Polovinka et al. 1994). They have also been identified in the basidiomycota Lentinus lepideus as secondary metabolites. After 12 days in the growth phase, ${\beta}$-elemene caryophyllene, ${\delta}$-cadiene, and eudesmane were detected with ${\beta}$-eudesmol. The data showed the synthesis of sesquiterpene hydrocarbons with bi-cyclic structures. These compounds can be synthesized from FPP by cyclization. Cyclic terpenoids are synthesized through the formation of a carbon skeleton from linear precursors by terpene cyclase, which is followed by chemical modification by oxidation, reduction, methylation, etc. Sesquiterpene cyclase is a key branch-point enzyme that catalyzes the complex intermolecular cyclization of the linear prenyl diphosphate into cyclic hydrocarbons (Toyomasu et al. 2007). After 20 days in stationary phase, the oxygenated structures eudesmol, elemol, and caryophyllene oxide were detected. Thus, after growth, sesquiterpenes were identified. Per these results, we showed that terpene metabolism in wood-rotting fungi occurs in the stationary phase. We also showed that such metabolism can be controlled by magnesium supplementation in the growth medium. In conclusion, we identified P. brumalis as a wood-rotting fungus that can produce sesquiterpenes. To mechanistically understand eudesmane-type sesquiterpene biosynthesis in P. brumalis, further research into the genes regulating the dynamics of such biosynthesis is warranted.

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