The nucleotide sequence of the luxC gene coding for lux-specific fatty acyl-CoA reductase and the upstream DNA (325bp)of the structural gene from bioluminescent bacterium, Photobacterium phosphoreum, has been deternubed. An open reading frame extending for more than 20 codons in 325 bp DNA upstream of luxC was not present in both directions. The lux gene can be translated into a polypeptide of 54 kDa and the amino acid sequences of lux specific reductases of P. phosphoreum shares 80, 65, 58, and 62% identity with those of the Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, and Xehnorhabdus luminescenens reductases, respectively. Analyses of codon usage, showing that a high frequency (2.3%) of the isoleucine codon, AUA, in the luxC gene compared to that found in Escherichia coli genes (0.2%) and its absence in the luxA and B genes, suggested that the AUA codon may play a modulator role in the expression of lux gene in E. coli. The structural genes (luxC, D, A, B, E) of the P. phosphoreum coding for luciferase (${\alpha}$,${\beta}$) and fatty acid reductase (r, s, t) polypeptides can be expressed exclusively in E. coli under the T7 phage RNA polymerase/promoter system and identificationof the [35S]methionine labelled polypeptide products. The degree of expression of lux genes in analyses of codon usage. High expression of the luxC gene could only be accomplished in a mutant E. coli 43R. Even in crude extracts, the acylated acyl-CoA reductase intermediate as well as acyl-CoA reductrase activities could be readily detected.
The gshI gene from the Escherichia coli K-12 strain codes for ${\gamma}-glutamylcysteine$ synthetase which mediates the rate-limiting step of glutathione biosynthesis. The isolated gshI gene from E. coli K-12 has an unusual translation initiation codon, UUG. The 494th amino acid is Ala rather than Gly which was found in a mutant strain E. coli B. In order to improve the translational rate of the gshI gene of E. coli K-12, the initiation codon, UUG, was changed to the usual AUG codon by the site-specific mutagenesis. This change has resulted in a 53% increase of ${\gamma}-glutamylcysteine$ synthetase activity. The enzyme activity was also improved by replacing $Ala^{494}$ with Val (A494V) or Leu (A494L). The replacement of $Ser^{495}$ with Thr (S495T) also resulted in a 62% increase of the enzyme activity. Therefore, the specific activity of ${\gamma}-glutamylcysteine$ synthetase was increased with the increasing chain length of the aliphathic amino acid at the site of the 494th amino acid (Ala<$Val{\leq}Leu$).
A cDNA, encoding the human growth hormone (hGH), was synthesized based on the known 191 amino acid sequence. Its codon usage was optimized for a high level expression in Escherichia coli. Unique restriction sites were incorporated throughout the gene to facilitate mutagenesis in further studies. To minimize an initiation translation problem, a 624-bp cassette that contained a ribosome binding site and a start codon were fused to the hGH-coding sequence that was flanked between the EcoRI and HindIII sites. The whole fragment was synthesized by an overlapped extension of eight long synthetic oligonucleotides. The four-short duplexes of DNA, which were first formed by annealing and filling-in with a Klenow fragment, were assembled to form a complete hGH gene. The hGH was cloned and expressed successfully using a pET17b plasmid that contained the T7 promoter. Recombinant hGH yielded as much as 20% of the total cellular proteins. However, the majority of the protein was in the form of insoluble inclusion bodies. N-terminal amino acid sequencing also showed that the hGH produced in E. coli contained formyl-methionine. This study provides a useful model for synthesis of the gene of interest and production of recombinant proteins in E. coli.
Reversible DNA watermarking is capable of continuous DNA storage and forgery prevention, and has the advantage of being able to analyze biological mutation processes by external watermarking by iterative process of concealment and restoration. In this paper, we propose a reversible DNA watermarking method based on histogram multiple shifting of noncoding DNA sequence that can prevent false start codon, maintain original sequence length, maintain high watermark capacity without biologic mutation. The proposed method transforms the non-coding region DNA sequence to the n-th code coefficients and embeds the multiple bits of the n-th code coefficients by the non-recursive histogram multiple shifting method. The multi-bit embedding process prevents the false start codon generation through comparison search between adjacent concealed nucleotide sequences. From the experimental results, it was confirmed that the proposed method has higher watermark capacity of 0.004-0.382 bpn than the conventional method and has higher watermark capacity than the additional data. Also, it was confirmed that false start codon was not generated unlike the conventional method.
The aim of this study was to investigate the prevalence of quinolone resistant E. coli from retail meat and to characterize the resistant determinants. Determination of minimum inhibitory concentration, the sequence analysis of gyrA, gyrB, parC, and parE quinolone resistance determining regions (QRDR), the presences of plasmid mediated quinolone resistance (PMQR) and the expression of efflux pump genes were investigated. Of the total 277 retail meat samples, 67 coli form bacteria were isolated. 15 of 67 isolates showed nalidixic acid resistance and 7 of 15 nalidixic acid resistant isolates were also resistant to ciprofloxacin, moxifloxacin and levofloxacin. 11 of 15 nalidixic acid resistant strains were isolated from chicken, 2 of 15 were isolated from beef and 2 of 15 were isolated from pork samples. 11 of 15 nalidixic acid resistant strains have single mutation at codon 87 (D87N or D87G) in gyrA, 2 of 11 gyrA mutants have double mutations at codon 86 and 87 (L86A and L87I) in parC with mutations at codon 434+445+465 or 429 in gyrB. 2 of 15 resistant isolates harbored qnrS, a PMQR determinant. Over expression of the acrB gene, efflux pump gene (3.93~16.53 fold), was observed in 10 of 15 resistant isolates.
Retroviral integration into ancient vertebrate genomes left traces that can shed light on the early history of viruses. In this study, we explored the early evolution of retroviruses by isolating nine Spuma endogenous retroviruses (ERVs) and one Epsilon ERV from the genomes of Agnatha and Chondrichthyes. Phylogenetic analysis of protein sequences revealed a striking pattern of co-evolution between jawless fish ERV and their host, while shark ERV underwent ancient cross-class viral transmission with jawless fish, ray-finned fish, and amphibians. Nucleotide sequence analysis showed that jawless fish ERV emerged in the Palaeozoic period, relatively later than ray-finned fish ERV. Moreover, codon analysis suggested that the jawless fish ERV employed an infection strategy that mimics the host codon. The genealogical diversity of ERVs in the jawless fish genome highlights the importance of studying different viral species. Overall, our findings provide valuable insights into the evolution of retroviruses and their interactions with their hosts.
Resistance to isoniazid (INH), which is one of the most important drugs in Mycobacterium tuberculosis chemotherapy, has been associated with mutations in genes encoding the mycobacterial catalse-peroxidase (katG), the enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase (inhA), alkyl hydroperoxide reductase (ahpC), beta-ketoacyl acyl carrier protein synthase (kasA), and NADH dehydrogenase (ndh). In this study, we examined INH-resistance related genes in 50 INH-resistant and 24 INH-susceptible isolates by PCR-sequence analysis. In brief, mutations at the katG gene were found at codon 315 alone (2/50), at codon 463 alone (19/50), and both at 315 and 463 (29/50). However, while mutations at codon 315 were only detected in INH-resistant isolates, mutations at codon 463 were also detected in INH-susceptible isolates indicating mutations at 463 alone do not seem to confer resistance to INH. Similar to the case of katG 463, some of inhA mutations were also found among INH-susceptible isolates. For example, whereas mutations at 8 upstream of the start codon (UPS) and 15 UPS of the inhA gene were detected only in INH-resistant isolates, mutations at 101, 115, and 125 UPS were detected only in INH-susceptible isolates. Many different kinds of mutations were detected in INHresistant isolates at ahpC, oxyR gene, and intergenic region of the oxyR-ahpC genes. Howerver, the mutations were not found oxyR and the intergenic regions in INH-susceptible isolates. No mutations were found at either kasA or at ndh gene among INH-resistant isolates. In conclusion, some of mutations such as katG 315, inhA promotor region, and oxyR-ahpC seem to be strongly related to INH-resistance. Currently we are developing a molecular diagnostic method based on these results.
Kim Junho;Kim Yeun;Bae Kiho;Song Taek-Sun;Cho Sang-Nae;Lee Hyeyoung
대한의생명과학회지
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제11권4호
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pp.465-471
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2005
Ofloxacin has antimycobacterial activity that possibly contributes a pivotal role in the second-line drug regimens that are used for the treatment of multidrug-resistant tuberculosis. However, in some communities, the resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to this agent is surging. Therefore, a rapid and accurate method that can be used to determine the resistance of M tuberculosis to the ofloxacin can be very useful for effective treatment of the patients. As an effort to develop such a method, this study was set up to reveal general types of mutations that are related to ofloxacin resistance of M tuberculosis. From previous studies, it has been well known that ofloxacin resistance is associated with mutations in a gene encoding the gyrase A subunit protein. In this study, we obtained 43 ofloxacin-resistant and 50 ofloxacin-susceptible M tuberculosis clinical isolates from Masan National TB Hospital, and sequences of DNA fragment of 320 bp, region of gyrA corresponding to the ofloxacin resistance-determining region were analyzed. In brief, the results showed that a total of seven mutation types were found at gyrA. Theses mutations were all clustered within nucleotides 2574 to 2586 of the gyrA gene (codons 88 to 94). Codon 94 was the most frequently substituted site. Twenty-four of the 43 isolates had mutations at this position resulting in a total of five different types of amino acid changes $(Asp{\to}Ala,\;Asp{\to}Gly,\;Asp{\to}His,\;Asp{\to}Tyr,\;and\;Asp{\to}Asn)$. Five isolates contained a mutation at codon 90 resulting $Ala{\to}Val$ change. Four isolates had mutations at codon 91 causing a $Ser{\to}Pro$ change at this site. Two isolates contained a mutation at codon 88 and each of them resulted in different types of amino acid changes $(Gly{\to}Cys,\;Gly{\to}Ala)$. On the other hand, polymorphic site at codon 95 was found in both ofloxacin-resistant and ofloxacin-susceptible isolates. From these results, we concluded that the rate of mutations present in gyrA among ofloxacin-resistant M. tuberculosis in Korea is similar to the general rates of mutations found throughout the world. Subsequently, an oligonucleotide probe was designed based on the results of sequence analysis and was used to develop a dot blot hybridization assay system to determine ofloxacin-resistance of M tuberculosis. To evaluate this probe, dot-blot hybridization was carried out using other 57 clinical isolates, and the results showed that the dot-blot hybridization assay is good for detecting sequence alterations atgyrA gene.
TBG 결핍증은 X 염색체 장완의 TBG 유전자의 돌연변이에 의해서 발생하며, 낮은 총 $T_4$와총$T_3$, 정상 유리 $T_4$와 유리 $T_3$, 정상 TSH 농도를 특징으로 한다. 혈청 티록신글로불린 농도에 따라 완전 TBG 결핍증과 부분 TBG 결핍증으로 나눌 수 있으며, 적절하게 진단하지 못하면 불필요한 검사나 치료의 요인이 될 수 있다. 저자들의 완전 TBG 결핍증으로 진단된 2명의 남아에 대하여 TBG 유전자 분석을 시행하였다. 대상아들은 신생아 선별검사에서 측정된 낮은 총 $T_4$ 농도 때문에 내원하였다. 진찰 소견은 정상이었으며, 갑상선 기능 검사 상 유리 $T_4$, TSH 농도는 정상이었다. 방사면역측정법에 의한 혈청 TBG는 측정되지 않았다. 중합효소연쇄반응을 이용하여 4개의 TBG 유전자 엑손을 증폭한 후 자동염기서열분석을 시행하였다. 두 대상아에서 모두 엑손 4의 352번째 codon의 첫 번째 단일 뉴클레오티드 C의 결손에 의한 frameshift 돌연변이로 374번째 codon에 termination codon이 나타난 것을 확인하였다. 대상아의 어머니들에게서는 돌연변이 대립유전자와 정상 대립유전자의 이형접합체를 확인하였다. 한국인 TBG 결핍증의 역학과 유전적 특성을 규명하기 위한 더 광범위한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
글루텔린은 쌀 종자단백질의 80% 수준에 이르는 산 또는 알칼리에 용해되는 가장 중요한 저장 단백질로, 분자량은 54 kDa 내외이며 22 kDa의 산성사슬과 32kd의 염기성사슬로 구성되어 있다. 지금까지 보고된 13개의 글루텔린 유전자의 염기서열로부터 유추된 단백질 서열의 다중분석에 의하여 계통발생적으로 1군에서 5군까지 5개군으로 나눌 수 있다. 각 군 상호유전자간의 염기서열과 아미노산서열의 유사성은 60%에서 90%에 이르어 이들 각 군은 매우 유사한 아미노산 조성을 보여주고 있다. 그러나 lysine 함량에 있어서는 2.5%에서 3.6%로 약간의 변화를 보여주고 있는데, 이는 argnine이 point mutation에 의하여 lysine으로 변화된 결과임을 알 수 있었다. 각 군에서의 성숙단백질과 염기성 사슬의 등전점은 각각 9.0, 10.0 내외로 매우 유사한 반면, 산성사슬은 각각 6.6, 6.7, 7.2, 8.4, 7.9의 독특한 값을 가지고 있다. 아울러 유전자 암호에서 세번째 염기가 G와 C로 끝나는 암호의 비율(fraction of G+C at synonimous site in codons: GC3s)과 유효 암호수(effective codon number, Nc), 우선 암호수(Preferred codon number)의 분석과 상관그래프는 글루텔린 유전자들의 전이효율의 차이는 거의 없어 유사한 수준으로 발현될 가능성을 제시하고 있다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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