• 식물조직배양학회지
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• 제28권4호
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• pp.197-200
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• 2001

상추에 제초제 저항성을 도입하기 위해 상추 자엽 조직을 NPTII-GUS 및 제초제 저항성 유전자 (PAT)가 삽입된 A. tumefaciens MP 90과 2일간 공동배양한 다음 0.1 mg.L$^{-1}$ NAA, 1.0 mg.L$^{-1}$ 2ip, 50 mg.L$^{-1}$ kanamycin, 500 mg.L$^{-1}$ carbenicillin을 첨가한 MS배지에 배양하여 식물체를 재분화시켰다. 재분화 식물체는 kanamycin 내성 검정을 통해 NPTII 유전자의 도입과, PCR, Northern blot 분석을 통해 제초제 저항성 유전자가 식물체의 게놈상에 삽입된 형질전환체임이 확인되었다. 또한 1500배액의 농도로 Basta를 살포한 결과 살포 10일 후 대조 식물체는 완전히 고사하는 데 반해 형질전환체는 지속적인 생육을 보여 얻어진 형질전환 상추가 제초제 저항성 개체임이 확인되었다.

• 농업과학연구
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• 제20권2호
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• pp.133-144
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• 1993

본(本) 연구(硏究)는 Agrobacterium tumefaciens을 binary vector system(C' 121, A' 121, L' 121)의 방법(方法)으로 처리(處理)하여 감자(Solanum tuberosum cv. Sumi)의 일반종서(一般種薯), microtuber 및 엽육조직(葉肉組織)과 줄기조직(組織)의 형질전환(形質轉換)을 유기(誘起)하기 위한 실험(實驗)을 수행(修行)하였다. Binary vector의 transconjugant는 triparental mating method에 의해 작성(作成)하였고, 이에 의해 만들어진 C'121, A' 121 및 L' 121을 cocultivation 처리방법(處理方法)으로 감자조직(組織)의 절편(切片)에 접종처리(接種處理)하고, cytokinin과 auxin을 여러 가지 농도(濃度)로 조합(組合)하여 첨가(添加)한 MS배지(培地)에서 배양(培養)한 결과(結果) C' 121과 A' 121 접종구(接種區)에서는 BA, NAA 및 2.4-D 복합처리시(複合處理時) NAA보다는 2,4-D의 농도(濃度)가 높아짐에 따라 callus의 분화(分化)가 증가(增加)되었고, 일반종서(一般種薯)에서의 callus는 쉽게 갈변(褐變)하여 증식(增殖)이 잘 되지 않았다. 또한, L' 121의 접중구(接種區)에서는 microtuber나 일반종서(一般種薯)에서도 거의 callus 형성(形成)되지 않았다. 2,4-D 단용처리시(單用處理時) C' 121과 A' 121 모두 높은 callus 분화율(分化率)을 나타냈지만 NAA 단용처리시(單用處理時)에는 2,4-D보다는 저조(低調)한 callus분화(分化)를 보였다. 2iP를 BA 대신(代身) 사용(使用)하였을 경우(境遇) L' 121에서도 높은 callus 분화율(分化率)을 보였고, callus의 증식(增殖)도 잘 이루어졌다. BA 1mg/l+NAA 0.01mg/l+Zeatin 0.5mg/l처리구(處理區)에서의 callus를 BA 2mg/l+2,4-D 1mg/l의 MS배지(培地)에 계대배양(繼代培養)한 결과(結果) embryo 및 shoot가 형성(形成)되었다. 기내배양(器內培養)한 엽육조직(葉肉組織)과 줄기조직(組織)은 Zeatin 2mg/l+NAA 0.01mg/l+GA 0.1mg/l혼합(混合) 처리구(處理區)에서 세가지 conjugants 모두에서 비교적(比較的) 높은 callus 형성율(形成率)을 보였다. 각 처리구(處理區)에서 얻어진 callus는 계대배양(繼代培養)에 의해 현재(現在)도 생육(生育)이 왕성(旺盛)하게 이루어지고 있어 빠르고, 효율적(效率的)인 식물체(植物體) 분화(分化)에 관한 연구(硏究)가 계속 수행(修行)되어질 것이다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제34권2호
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• pp.139-144
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• 2007

'정상' 배추의 배축절편을 선발마커로서 paromomycin 저항 성유전자를 갖고 있는 pPTN290으로 각각 형질전환된 EHA101, LBA4404, GV3101균주와 공동배양한 후 갤러스유도배지에서 형질전환캘러스를 얻은 후, 뿌리유도배지에서 부정근을 그리고 신초유도배지에서 신초를 각각 순차적으로 유도하였다. 형질전환캘러스를 얻은 후, 뿌리유도배지에서 부정근을 그리고 신초유도배지에서 신초를 가각 순차적으로 유도하였다. 형질전환캘러스 형성은 Agrobacterium균주에 따라 차이가 있었으며, 특히 EHA101균주에 공동배양된 배축절편으로부터 최대 6.1%까지 얻어졌다. 또한 각각의 형질전환캘러스 클론으로부터 형질전환 부정근과 신초 발생은 EHA101균주에서 60.7%와 38.2%, LBA4404에서 8.3%와 0%, GV3101에서 20.5%와 85.7%까지 각각 얻을 수 있었다. 형질전환식물체는 특별한 형태적 이상 없이 온실에서 정상적으로 자라 $T_{2}$종자를 얻을 수 있었다. GUS방법으로 7개의 후대 유식물체를 분석한 결과 gus유전자가 안정적으로 발현하고 있음을 확인하였고, 배추 genome에 single 또는 multiple copy로 전달되고 있음을 추측할 수 있었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제29권2호
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• pp.93-98
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• 2002

바이러스 설사병의 원인인 VP6유전자를 감자에 형질전환 시키기 위하여 CaMV 35S promoter와 kanamycin 항생제 내성을 갖는 식물발현벡터 pMBP-1에 subcloning하고, 이 재조합 벡터를 A. tumefaciens LBA4404에 도입시킨 후, freeze haw방법을 이용하여 감자에 형질전환 시켰다. 공동배양된 감자의 잎절편은 2,4-D가 2.0 mg/L첨가된 배지에서 2일간 배양 후, 0.01 mg/L NAA, 0.1 mg/L GA$_3$, 2.0 mg/L Zeatin, 100.0 mg/L kanamycin, 500.0 mg/L carbenicillin이 첨가된 선발배지에서 재분화시켰다. 이 때 유도된 신초는 100.0 mg/L의 kanamycin이 포함된 배지에 옮겨준 후, 왕성한 생육을 위해 MS 기본배지에서 다시 배양하였다. 기내배양시 외부유전자의 도입에 의한 외형적인 변화는 찾을 수 없었으며, 형질전환체는 NPT primer를 사용한 PCR방법으로 1차선별 하였다. DIG 표지된 probe를 이용하여 total RNA를 분석한 결과 개체별로 발현양의 차이는 있었으나, 95% 이상의 안정성을 보였고, genomic DNA를 추출해 Southern blot hybridization했을 경우 1~3개의 copy수를 보임으로써 형질전환 식물체에 외래유전자인 VP6유전자가 안정적으로 도입되었음이 확인되었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제26권3호
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• pp.163-169
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• 1999

우리나라의 주요 개량 포플러의 하나인 현사시 3호를 대상으로 Arobacterium tumefaciens MP 90/PAT을 이용하여 비선택성 제초제인 Basta에 내성을 갖는 형질전환체를 획득하고자 본 실험을 수행하였다. 기내 배양된 엽절편을 재료로 균주에 10분간 감염, 2일간 공조 배양 및 3주간 선발배지에서 배양으로 kanamycin에 내성을 갖는 잠정적인 형질전환 캘러스를 유도하였다. 선발된 캘러스로부터 배양 4주 후 줄기를 유도하였으며, 증식된 줄기는 발근시켜 완전한 형질전환체를 얻었다. 형질전환체는 PCR기법 및 Southern blot 분석으로 PAT 유전자 전이를 확인하고. 유전자의 발현은 GUS 유전자의 발색 반응으로 확인하였다. 형질전환체는 폿트로 이식하여 4주간 생장시킨 후 제초제 Basta로 살포한 결과 대조구 식물체는 고사되었으나, 형질전환체는 정상적인 생육이 가능하였다

• 식물조직배양학회지
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• 제25권3호
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• pp.207-217
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• 1998

한국에서 자생한 자연산 tumor 조직과 근권토양으로부터 형질전환율이 높은 hypervirulent Agrobacterium spp를 분리하기 위해서 Salix, Diospyros, Populus 및 Malus에서 형성된 tumor 조직과 근권토양을 채취하괴 Schroth 선택배지와 New and Kerr 배지를 이용하여 78 균주의 colony를 특성에 따라 분리하였다. 이중에서 48 균주가 당근 disc에서 tumor를 형성하였으며 tumor를 형성한 균주중 형성시기가 빠르며 크기가 커 hypervirulent 균주로 생각되는 A. tumefaciens SP101을 biotype 1, 그리고 A. tumefaciens SM042를 biotype 2로 동정하였다. 토양중에서 선발한 A. tumefaciens SM042와 disarmed A. tumefaciens PC2760에 kanamycin 저항성 유전자를 함유하고 있는 binary vector pGA643을 도입하여 conjugant인 A. tumefaciens SM643과 A. tumefaciens PC643을 kanamycin과 tetracycline이 함유된 최소배지에서 획득하였다. 연초의 형질전환을 위해서 conjugant Agrobacterium과 연초조직을 동시배양 후 2,4-D와 kanamycin이 함유된 선발배지에 치상하여 형질전환을 유도한 결과 A. tumefaciens SM643이 A. tumefaciens PC643보다 더 많은 캘러스가 형성되었다. 그러나 A. tumefaciens PC643을 사용한 형질전환 캘러스는 대부분 friable한 캘러스로 유도되었으며 정상적으로 식물체로 생장하였으나 A. tumefaciens SM643을 사용한 캘러스는 매우 딱딱하며 둥그런 형태의 캘러스와 friable한 캘러스가 혼재한 상태로 생장하였으며, 이중에서 friable한 캘러스는 정상적인 shoot가 형성되었으나 딱딱한 캘러스로 유도된 형질전환체는 식물체로 형성되지 않고 반구형 미색의 전형적인 tumor 캘러스로 생장하였다. 한편 형질전환시 캘러스를 유도하지 않고 직접 shoot를 형성시킨 결과 disarmed Ti-plasmid를 사용하지 않고 wild-type Ti-plasmid를 사용해도 정상적인 형질전환체를 획득할 수 있었다.

• 원예과학기술지
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• 제17권5호
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• pp.578-580
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• 1999

춘란 뿌리에서 분리한 Rhizoctonia속 난 균근균 3종이 난의 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 난 균근균을 기내에서 자라는 한란(제주한란${\times}$일본한란 '남국(南國)' 교잡종) 및 호접란 유묘와 2개월간 공동배양한 다음 온실에서 18개월간 재배하면서 식물체와 균근균과의 공생관계를 조사하였다. 기내에서 2개월간 공동배양한 결과 제주한란${\times}$일본한란 '남국(南國)' 교잡종과 호접란 모두 엽장, 엽수, 엽폭 등 지상부와 근수, 근장 등 지하부 및 생체중에 있어서 무처리구와 균근 균 처리구 간에 차이가 없었다. 4개월간 순화 재배한 결과는 제주한란${\times}$일본한란 '남국(南國)' 교잡종의 경우 P1 균(Rhizoctonia repens) 처리구에서 지상부와 지하부의 생육이 가장 양호하였고, 호접란은 무처리구와 균근균 처리간에 차이가 없었다. 온실에서 1년 6개월 동안 재배한 결과 제주한란${\times}$일본한란 '남국(南國)' 교잡종은 무처리구에 비해 P1 균 처리구에서 초장, 신초수, 엽수, 뿌리수 및 생체중이 증가하였으나, P2 균(R. endophytica) 처리구에서는 오히려 감소하였으며, P3 균(R. repens : P1 균과는 다른 균주임) 처리구에서는 차이가 없었다. 호접란의 경우 무처리구에 비해 P1 균 처리구에서 초장과 생체중이 증가하였다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, P1 균이 제주한란${\times}$일본한란 '남국(南國)' 교잡종의 생육을 크게 촉진한 것으로 나타났다.

• 한국산림과학회지
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• 제87권2호
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• pp.164-172
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• 1998

Promoter가 없는 외래유전자를 이용하여 형질전환(形質轉換)시키고자 할 때의 최적조건(最適條件) 및 효율적인 형질전환체(形質轉換體)의 검정방법을 구명(究明)하고자 산림청(山林廳) 임목육종연구소(林木育種硏究所)에 식재된 잡종 포플러 양황철 62-9클론을 사용하여 재분화를 유도하고, 기내(器內) 형질전환실험(形質轉換實驗)을 실시하였다. 기내(器內)에서 식물체 재분화 유도를 위해서는 배지조성과 호르몬 농도의 조합이 가장 영향을 많이 끼치는 요인이었다. 여러 조합으로 엽조직 ($5{\times}5mm$ leaf strip)을 시료로 하여 MS 기본배지에 0, 0.01, 0.1, 0.5, $0.1mg/{\ell}$ NAA, 0.2, 0.5, 1.0, $2.0mg/{\ell}$ BAP를 혼합 처리하여 배양한 결과, $0.1mg/{\ell}$ NAA, $0.5mg/{\ell}$ BAP를 첨가한 호르몬 조합에서 즐기 분화율 및 explant당 분화된 부정줄기수가 상대적인 비율 94%(11.4개)로서 가장 높았다. 따라서 형질전환(形質轉換)된 엽조직(葉組織)을 재분화 시킬 때 이 조건을 줄기분화유도 배지 (SIM ; shoot-inducing medium)로 사용하였다. 선발유전자에 의한 항생제(抗生濟)의 선발농도(選拔濃度)를 알기 위해 pBI121로 형질전환(形質轉換)실험을 한 결과, cocultivation한 후 $100mg/{\ell}$ Km(kanamycin) 또는 $60mg/{\ell}$ G418(geneticin)이 첨가된 SIM 3 배지에서 2주가 경과하면서 육안으로 형질전환(形質轉換)된 부정아를 관찰할 수 있었고 이 부정아를 SIM 3로 옮긴지 6주 후에는 0.5-1cm 크기의 부정줄기로 자랐다. 그러나 대조(對照) 엽조직(葉組織)은 부정아형성이 거의 되지 않아, 선발유전자의 항생제(抗生濟) 선발농도(選拔濃度)는 이 조건이 최적임을 알 수 있었다. 또한 형질전환체(形質轉換體)의 재분화율을 높이기 위해 5-azacytidine을 처리한 결과, 항생제(抗生濟) 선발배지하에서 재분회율을 5.7%에서 26.7%까지 높일 수 있었다. Fluorometric 및 histochemical assay 방법으로 GUS 유전자의 활성(活生)을 검정한 결과 vector system간에 형질전환율(形質轉換率)이 서로 다름을 확인할 수 있었다. LBA4404/pBI121을 vector로 사용한 양황철의 기내(器內) 형질전환(形質轉換) 실험에서는 낮은 形짧훌훌換率(5.7%)을 보였다. 그러나 보다 응양성(應梁性)이 높은 super virulence 유전자를 포함하는 pEHA101을 helper plasmid로 하여 실험한 결과 형질전환율(形質轉換率)이 35.9%로 pAL4404보다 훨씬 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 promoter가 없는 외래유전자를 이용하여 promoter tagging을 하고자 할 때 형질전환(形質轉換)실험에는 helper plasmid로써 pEHA101을 이용하는 것이 적합한 것으로 판명되었다.