Successful techniques of in vitro fertilization(IVF) are valuable for studying the process of fertilization and for developing economical procedures for gene and nuclear transfer in farm animals. To date, bovine IVF system has been developed with oocytes in vitro or vitro, but the resulting zygotes exhibit limited embryonic development after in vitro culture. Even though in vitro matured oocytes achieved high fertilization and cleavage rates, these embryos appear extremly low rate of pregnancies when transferred to synchronized recipients. Development of early bovine embryos in vitro is generally arrested at the 8-to 16-cell stage. However, recent use of somatic cells such as trophoblastic vesicle, granulosa and oviduct epithelial cell for co-culture with early bovine embryos has proven effective for development of embryos, matured and fertilized in vitro, past the in vitro cell blocks. These factors clearly indicate the value of the co-culture system in promoting development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro to morula or blastocyst stage in vitro. In addition, co-culture system may beome a tool for evaluation of viability of ova that have been manipulated by procedures such as splitting, microinjection and nuclear transfer.
In order to achieve successful in vitro production of embryo, it is necessary to establish intrauterine environment during in vitro culture. Thus, this study was investigated to establish embryo culture system using co-incubated collagen matrix gel (CM) with endometrial epithelial cells (EC). Endometrial epithelial cells were isolated from porcine endometrium at follicular phase, the cells seeded in insert dish for co-incubation with CM-coated culture dish. Then, culture media treated with/without 2.0 IU/ml hCG or 10 ng/ml $IL-1{\beta}$. After incubation for 24 h, the co-incubated insert dishes were removed from CM-coated culture dish before embryo culture. Embryos at 48 h after in vitro fertilization (IVF) were cultured on the dish for 120 h with porcine zygote medium. We determined PTGS-2 expression in the ECs, VEGF protein in co-incubated CM with EC and observed cleavage rate and blastocyst development of embryos at 168 h after IVF. In result, expression of PTGS-2 was higher at co-incubated EC with hCG and $IL-1{\beta}$ groups than EC without hCG and $IL-1{\beta}$. The VEGF protein was detected at co-incubated CM with EC, EC treated with hCG and $IL-1{\beta}$ groups higher than CM group. Also, cleavage rate was no significantly difference among all group, however, blastocyst development was significantly higher in co-incubated CM with EC treated with hCG group than un-treated groups (p<0.05). Therefore, we suggest that novel embryo culture system using co-incubated collagen matrix gel with endometrial epithelial cells treated with $IL-1{\beta}$ is beneficial and useful for enhancing the production of porcine blastocysts in vitro.
The effect of oxygen tension on embryonic development in co-culture was evaluated from the standpoint of the reduction of dissolved oxygen concentration by the oxygen consumption of feeder cells. Three co-culture systems using bovine oviductal epitherial cells (BOEC), African green monkey kidney cells (Vero cells) or buffalo rat liver cells (BRLC) have been compared in terms of development of bovine embryos derived from oocytes matured and fertilized in vitro. Among the co-cultured embryo, Vero cells su, pp.rted the highest developmental rate (29%) and the other two showed the similar rates. When the co-cultures were incubated in three different oxygen tension such as 5, 10, 20% oxygen atmosphere, embryos co-cultured with Vero cells at 10%-O2 resulted in the highest percentage of development. From the measurement of oxygen consumption of feeder cells, BRLC consumed 1.38 10-10 mg-O2/min/cell which was higher than 0.94 10-10 and 0.26 10-10mg-O2/min/cell for Vero cells and BOEC, respectively. Based on the oxygen consumption data, the phenomena of optimum oxygen tension required in embryo development in vitro has been analyzed, and we suggested that gas phase oxygen concentration, oxygen consumption rate of feeder cells and the number of feeder cells should be considered for the design of optimal co-culture system for effective fertilization of embryos in vitro.
Sang-Yun Lee;Seong-Ju Oh;Rubel Miah;Yong-Ho Choe;Sung-Lim Lee;Yeon Woo Jeong;Young-Bum Son
한국동물생명공학회지
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제39권2호
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pp.95-104
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2024
Background: In healthy dentin conditions, odontoblasts have an important role such as protection from invasion of pathogens. In mammalian teeth, progenitors such as mesenchymal stem cells (MSCs) can migrate and differentiate into odontoblast-like cells, leading to the formation of reparative dentin. For differentiation using stem cells, it is crucial to provide conditions similar to the complex and intricate in vivo environment. The purpose of this study was to evaluate the potential of differentiation into odonto/osteoblasts, and compare co-culture with/without epithelial cells. Methods: MSCs and epithelial cells were successfully isolated from dental tissues. We investigated the influences of epithelial cells on the differentiation process of dental pulp stem cells into odonto/osteoblasts using co-culture systems. The differentiation potential with/without epithelial cells was analyzed for the expression of specific markers and calcium contents. Results: Differentiated odonto/osteoblast derived from dental pulp tissue-derived mesenchymal stem cells with/without epithelial cells were evaluated by qRT-PCR, immunostaining, calcium content, and ALP staining. The expression of odonto/osteoblast-specific markers, calcium content, and ALP staining intensity were significantly increased in differentiated cells. Moreover, the odonto/osteogenic differentiation capacity with epithelial cells co-culture was significantly higher than without epithelial cells co-culture. Conclusions: These results suggest that odonto/osteogenic differentiation co-cultured with epithelial cells has a more efficient application.
Somatic cells such as oviduct epithelial cell, uterine epithelial cell, cumulus-granulosa cell and buffalo rat river cell has been used to establish an effective culture system for bovine embryos produced in in vitro. But nitric oxide (NO) metabolites secreted from somatic cells were largely arrested the development of bovine in vitro matured/ in vitro fertilized (IVM/IVF) embryos, suggesting that NO was induced the embryonic toxic substance into culture medium. The objective of this study was to investigate whether BOEC co-culture system can ameliorate the NO-mediated oxidative stress in the culture of bovine IVM/IVF embryos. Therefore, we evaluated the developmental rate of bovine IVM/IVF embryos under BOEC co-culture system in the presence or absence of sodium nitroprusside (SNP), as a NO donor, and also detected the expression of growth factor (TGF-$\beta$, EGF and IGFBP) and apoptosis (Caspase-3, Bax and Bcl-2) genes. The supplement of SNP over 5 uM was strongly inhibited blastocyst development of bovine IVM/IVF embryos than in control and 1 uM SNP group (Table 2). The developmental rates beyond morulae stages of bovine IVM/IVF embryos co-cultured with BOEC regardless of SNP supplement (40.4% in 5 uM SNP+ BOEC group and 65.1% in BOEC group) were significantly increased than those of control (35.0%) and SNP single treatment group (23.3%, p<0.05: Table 3). The transcripts of Bax and Caspase-3 genes were detected in all experiment groups (1:Isolated fresh cell (IFC), 2:Primary culture cell (PCC), 3:PCC after using the embryo culture, 4: PCC containing 5 uM SNP and 5: PCC containing 5 uM SNP after using the embryo culture), but Bcl-2 gene was not detected in IFC and PCC (Fig. 1). In the expression of growth factor genes, TGF-$\beta$ gene was found in all experimental groups, and EGF and IGFBP genes were not found in IFC and PCC (Fig. 2). These results indicate that BOEC co-culture system can increase the development beyond morula stages of bovine IVM/IVF embryos, possibly suggesting the alleviation of embryonic toxic substance like nitric oxide.
The present study was carried out to investigate the effects of co-culture cells and growth factors on in vitro culture of Korean native cattle(KNC) embryos fertilized in vitro. Two-eight cell embryos were cultured in vitro using 4 types of co-culture cells and 3 growth factors singly or in combination. The results were as follows, In the co-culture of 2~8 cell embryos with bovine oviductal epithelial cell(BOEC), granulosa cell(BGC), uterine epithelial cell(BUEC) and mouse embryonic fibroblast (MEF) monolayers, the developing rate to blastocysts was significantly(P<0.05) higher with BUEC(32.1%) than with MEF(15.3%), BGC(13.2%) and non co-culture control(11.6%). When the morula co-cultured with BOEC for 5 days following in vitro fertilization were co-cultured with BOEC continuously or with BUEC, respectively, the developing rate to blastocysts was higher with BUEC(73.9%) than with BOEC(56.0%). To examine the effects of growth factors on in vitro development of 2~8 cell embryos, epidermal growth factor(EGF), transforming growth factor-$\beta$l(TGF-$\beta$l) and insulin-like growth factor-1(IGF-1) were added singly or in combination to TCM 199 maturation medium with respective concentration. In a addition of each 10, 30 and SOng /rnl EGF, the developing rate to blastocysts was the highest in lOng /ml EGF(25.3%). In addition of each 1, 2 and Sng /mi TGF-$\beta$1, the developing rate to blastocysts was the highest in lng /ml TGF-$\beta$1(28.8%). In addition of each 50, 100ng/ml JGF-l, the developing rate to blastocysts was higher in 100ng/ml IGF-l(16.5%) than in SOng/mi IGF-1(12.9%). When lOng /ml EGF and lng /ml TGF-$\beta$l was added singly or in combination, the developing rate to blastocysts was similar in groups added singly or in combination with EGF and TGF-$\beta$l (23.l~24.6%), although higher than in control(16.7%). In the co-culture of 2~8 cell embryos Wth BOEC + each 10, 30 and 5Ong /rnl EGF, the developing rate to blastocysts was significantly(p<0.05) higher in BOEC + long /ml EGF(32.3%) than in BOEC + 3Ong /ml EGF(18.9%) and BOEC + song /ml EGF(9.7%). In the co-culture of 2~8 cell embryos with BOEC + each 1, 2, Sng /ml TGF-$\beta$l the developing rate to blastocysts was higher in BOEC + Sng/rnl TGF-$\beta$l(28.2%) than in BOEC + lng /ml TGF-$\beta$l(21.7%) and BOEC + 2ng/ml TGF-$\beta$l(21.4%). In summary, higher developing rate to blastocysts were obtained with co-culture of BUEC for co-culture system, with addition of lOng /ml EGF or lng /ml TGF-$\beta$l for growth factor culture system, and with co-culture of BOEC + lOng /ml EGF or BOEC + Sng /ml TGF-$\beta$l for co-culture + growth factor culture system.
Gel bead의 효율적인 이용을 목적으로 산소요구성이 전혀 다른 두 균주로 구성된 혼합고정화 배양계의 개발을 시도하였다. 호기성 균으로서 A. awamori, 혐기성균으로서 Z. mobilis를 사용하여 생전분으로 부터 에탄올 생산을 행한 결과는 다음과 같다. 두 균주의 최적 혼합비율은 A. awamori $1.25{\times}10^{9}\;spore/L-gel$, Z. mobilis 0.5g cell/L-gel이었다. 배양이 완료된 후의 gel bead 내의 균주 분포는 각각 혐기부와 호기부, 즉 gel bead의 표면부와 중심부로 생육장소가 구분되어 있었다. A-Z계의 배양에서는 에탄올의 수율이 낮았고, 균사가 gel bead로 부터 누출되었다. 배양 개시 후 36시간째에 배양기의 면전을 특수 제조한 check valve가 부착된 실리콘 plug로 교환하여 혐기적 배양을 행한 A-Z 36계에서는 gel bead로 부터 균사의 누출이 상당히 억제되었고, pH가 4.3을 유지하면서, 에탄올의 수율이 대조구 보다 약2배 높게 나타났다.
This study attempted to improve the growth of the freshwater microalgae, Parachlorella kessleri, through the sequential optimization of culture conditions. This attempt aimed to enhance the microalgae's ability to fixate atmospheric CO2. Culture temperature and light intensity appropriate for microalgal growth were scanned using a high-throughput photobioreactor system. The supplied air flow rate varied from 0.05 to 0.3 vvm, and its effect on the growth rate of P. kessleri was determined. Next, sodium phosphate buffer was added to the culture medium (BG11) to enhance CO2 fixation by increasing the availability of CO2(HCO3-) in the culture medium. The results indicated that optimal culture temperature and light intensity were 20℃-25℃ and 300 μE/m2/s, respectively. Growth rates of P. kessleri under various air flow rates highly depended on the increase of the culture's flow rate and pH which determines CO2 availability. Adding sodium phosphate buffer to BG11 to maintain a constant neutral pH (7.0) improved microalgal growth compared to control conditions (BG11 without sodium phosphate). These results indicate that the CO2 fixation rate in the air could be enhanced via the sequential optimization of microalgal culture conditions.
This study was carried out to investigate the effect of biological factors on the in vitro production(IVP) of bovine oocytes for development of simple culture methods and medium. Oocytes from the slaughterhouse ovaries were matured and fertilized using general protocol and this study was examined if there were necessary to co-culture, media change, media type and embryo density. This results were as follows: 1. The development rate according to co-culture with cumulus cells and non co-culture as drop culture was not significantly different in cleavage (68.9 vs 71.7%), 8-cell stage (41.2 vs 44.1%) and blastocyst stage (12.2 vs 13.8%), respectively (p<0.05) 2. The blastocyst development rates in YS and CRIaa were higher than that in TCM199 (12.4, 10.4$ vs 3.7%), but the cleavage (69.0, 77.8 and 61.0%) and 8-cell stage (31.7, 37.0 and 35.7%) development accoring to YS, TCM199 and CRIaa ws not significantly different, respectively (p<0.05). 3. There was no significantly different in cleavage (62.6, 59.5 and 61.2%), 8-cell(34.7, 37.9 and 34.0%) and blastocyst (9.5, 11.6 and 12.8%) development among medium change time as control, Group I and Group II, respectively (p<0.05). 4. Blastocyst formation of 8-cell stage according to embryo density was not significantly different in 1, 10 and 25 embryos (27.3, 22.5 and 34.0%), respectively (p<0.05). These results indicated that simple culture system could reduce bovine IVP embryos as drop culture as non co-culture system, high density embryo (25 embryos/50 $\mu$1 drop). YS defined medium and no medium change for whole culture period, although other biological factors need to examine in order to produce efficient IVP bovine embryos.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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