Previous studies have shown that BMI-1026 is a potent inhibitor of the cyclin-dependent kinases (cdk). In cell culture, the compound also arrests G2/M strongly and G1/S and S weakly. Two key kinases, cdk1 (p34cdc2 kinase) and mitogen-activated protein (MAP) kinase (erk1 and 2), perform crucial roles during oocyte maturation and, later, metaphase II (MII) arrest. In mammalian oocytes, both kinases are activated gradually around the time of germinal vesicle breakdown (GVBD) and maintain high activity in eggs arrested at metaphase II. In this study, we examined the effects of BMI-1026 on GVBD and MII arrest in mouse oocytes. BMI-1026 inhibited GVBD of immature oocytes and activated MII-arrested oocytes in a concentration-dependent manner, with more than 90% of oocytes exhibiting GVBD inhibition and MII activation at 100 nM This is approximately 500$\sim$1,000 times more potent than the activity reported for the cdk inhibitors roscovitine (${\sim}50{\mu}M$) and butyrolactone (${\sim}100{\mu}M$). Based on the results of previous in vitro kinase assays, we expected BMI-1026 to inhibit only cdk1 activation in oocytes and eggs, not MAP kinase. However, in our cell-based system, it inhibited the activity of both kinases. We also found that the effect of BMI-1026 is reversible. Our results suggest that BMI-1026 inhibits GVBD and activates MII-arrested oocytes efficiently and reversibly and that it also inhibits both cdk1/histone HI kinase and MAP kinase in mouse oocytes.
Recently, there has been significant progress in understanding the control process of the cell division cycle. To investigate the influence of toxic substances on the cell cycle, the effect of benzo(a)pyrene (BAP) and mitomycine C (MMC) on synchronized HeLa cells was analyzed during the cell cycle. To synchronize the HeLa cells, 10$^{6}$ cells were grown for 1 day and then treated with 1 mM hydroxyurea for 14 h. The arrested cells were then allowed to proceed through their cell cycle by removing the hydroxyurea and resupplying a fresh medium. The arrested cells in the G1/S transition then proceeded to the S phase after 4 h, the G2/M phase after 8h, and the G1 phase after 12 h, subsequent to the resupply of a fresh medium. In the untreated HeLa cells, the p34$^{cdc2}$ kinase activity, measured using a p34$^{cdc2}$ specific peptide, peaked after 8h (G2/M) and then declined after 12 h (G1). However, treatment with 30 $\mu$M BAP delayed the peak of the p34$^{cdc2}$ kinase activity. The amount of p34$^{cdc2}$ remained unchanged in the untreated, BAP-, and MMC-treated cells throughout the cell cycle. The cyclin B level peaked after 8 h in the untreated cells, yet peaked after 10-12 h in the BAP-treated cells. There was no significant change in the cyclin B level in the MMC-treated cells.
During mitosis, genomic integrity is maintained by the proper coordination of anaphase entry and mitotic exit via mitotic checkpoints. In budding yeast, mitotic exit is controlled by a regulatory cascade called the mitotic exit network (MEN). The MEN is regulated by a small GTPase, Tem1p, which in turn is controlled by a two-component GAP, Bfa1p-Bub2p. Recent results suggested that phosphorylation of Bfa1p by the polorelated kinase Cdc5p is also required for triggering mitotic exit, since it decreases the GAP activity of Bfa1p-Bub2p. However, the dispensability of GEF Lte1p for mitotic exit has raised questions about regulation of the MEN by the GTPase activity of Tem1p. We isolated a Bfa1p mutant, $Bfa1p^{E438K}$, whose overexpression only partially induced anaphase arrest. The molecular and biochemical functions of $Bfa1p^{E438K}$ are similar to those of wild type Bfa1p, except for decreased GAP activity. Interestingly, in $BFA1^{E438K}$ cells, the MEN could be regulated with nearly wild type kinetics at physiological temperature, as well as in response to various checkpoint-activating signals, but the cells were more sensitive to spindle damage than wild type. These results suggest that the GAP activity of Bfa1p-Bub2p is responsible for the mitotic arrest caused by spindle damage and Bfa1p overproduction. In addition, the viability of cdc5-2 ${\Delta}bfa1 $ cells was not reduced by $BFA1^{E438K}$, suggesting that Cdc5p also regulates Bfa1p to activate mitotic exit by other mechanism(s), besides phosphorylation.
Wee1 인산화효소는 세포주기 조절의 핵심 단백질인 cdc2/cyclinB 복합체를 인산화하여 활성을 억제, 조절하는 주요한 효소이다. 지금까지 포유동물에서는 Wee1A, Wee1B 그리고 Myt1의 세 가지 효소가 발견되었다. Wee1 인산화효소의 조절기작을 연구하기 위하여 생쥐의 Wee1A와 Wee1B를 발톱개구리의 난자에 주사한 후 단백질의 변형을 관찰하였다. 이 세포주기 과정에서 두 효소는 모두 인산화 되었으며, Wee1A단백질은 분해되는 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 세포외 인산화 방법을 통하여 Wee1A가 PKA와 Akt에 의해 인산화됨을 확인하였다. 이러한 Wee1 인산화효소의 인산화와 단백질 안정성에 영향을 미치는 단백질 내의 부위를 살펴보고자, Wee1A와 Wee1B의 아미노 도메인과 카르복실 도메인을 서로 치환한 단백질을 제조하여 개구리 난자에 주사하고 인산화 정도와 단백질의 안정성을 조사하였을 때, Wee1A의 아미노 도메인이 단백질의 인산화와 안정화에 중요한 영향을 미친다는 것을 규명하였다. 그리고 Wee1B의 아미노 도메인과 Wee1A의 카르복실 도메인은 효소의 활성을 조절하는 역할을 한다.
BACKGROUND/OBJECTIVES: Non-small cell lung cancer is mostly recognized among other types of lung cancer with a poor prognosis by cause of chemotherapeutic resistance and increased metastasis. Luteolin has been found to decrease cell metastasis. However, its underlying mechanisms remain unresolved. The objective of this study was to examine the effect (and its mechanism) of luteolin on the migration and invasion of human non-small cell lung cancer A549 cells. MATERIALS/METHODS: Cell viability was investigated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. Wound healing and transwell assays were evaluated to assess migration and invasion, respectively. Western blot analysis and immunofluorescence were further performed to investigate the role of luteolin and its mechanisms of action. RESULTS: Administration with up to 40 μM luteolin showed no cytotoxic activity on lung cancer A549 cells or non-cancer MRC-5 cells. Additionally, luteolin at 20-40 μM significantly suppressed A549 cells' migration, invasion, and the formation of filopodia in a concentration-dependent manner at 24 h. This is similar with western blot analysis, which revealed diminished the phosphorylated focal adhesion kinase (pFAK), phosphorylated non-receptor tyrosine kinase (pSrc), Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1), cell division control protein 42 (Cdc42), and Ras homolog gene family member A (RhoA) expression levels. CONCLUSIONS: Overall, our data indicate that luteolin plays a role in controlling lung cancer cells' migration and invasion via Src/FAK and its downstream Rac1, Cdc42, and RhoA pathways. Luteolin might be considered a promising candidate for suppressing invasion and metastasis of lung cancer cells.
목적: K562 세포의 방사선에 의한 세포 사망은 mitotic catastrophe 현상이 위주로 나타나지만 herbimycin A (HMA)에 의하여 apoptosis 반응이 촉진되는 반면 genisteln에 의하여 두 가지 형태의 세포사망이 모두 억제된다. 본 연구에서는 HMA와 genistein에 의한 K562세포의 방사선 유도 세포주기 조절 변화와 세포 사망 양상의 연관성을 조사하였다. 대상 및 방법: 지수증식기의 KS62 세포에 6 MV 선형가속기(Clinac 1,m C, Varian)를 이용하여 200~300 cGy/min의 선량률로 10 Gy를 균일하게 조사하였다. HMA와 genistein은 각각 250 nM와 25$\mu$M농도로 방사선 조사 후 즉시 투여하였다. 실험에서는 세포주기, 오절인자의 발현 및 활성, 노화 및 분화정도 등에 있어서의 시간에 따른 변화를 조사하였다. 결과: 방사선 단독조사에서 KS62세포는 G2기의 정체를 보였으나 정상적인 053을 가지는 세포와는 달리 지속적인 세포주기의 정체를 보이지 않았다. G2정체가 유지되는 동안 cyclin Bl의 점진적인 증가를 관찰할 수 있었으며, 이는 염색체의 복제가 완료되지 않은 상태에서 M기로 진행하여 미성숙한 염색체 응축과 mitotic catastrophe 현상이 나타나는 것과 일치한다. 방사선 조사와 함께 HMA를 투여한 경우에는 G2정체가 빠르게 해소되었으며 동시에 Gl기에서 세포가 정체되는 양상을 보였다. 세포주기 조절인자 cdc2 kinase 활성 증가와 cyclln I와 A 발현 및 CDK2 활성의 감소 등의 현상으로 설명되며, 이는 apoptosis의 증가와 연관성을 갖는다. 반면 genistein의 경우에는 cyclin Bl과 떨cfsc 발현 및 cdc2활성이 모두 감소하는 등 G2정체를 계속 유지하였다. 이와 함께 방사선에 의한 노화와 megakaryocyte로의 분화도 지속되는 것을 관찰할 수 있었다. 결론: HMA와 genistein에 의한 KS62세포의 방사선 유도 세포사망의 변화는 세포주기 조절과 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 이는 다양한 방사선 유도 세포사망의 기전을 이해하는 데 독창적인 모델을 제공하며, 방사선을 이용한 암 치료법의 개발에 새로운 표적을 제공할 수 있을 것이다.
To maintain cellular homeostasis against the demands of the extracellular environment, a precise regulation of kinases and phosphatases is essential. In cell cycle regulation mechanisms, activation of the cyclin-dependent kinase (CDK1) and cyclin B complex (CDK1:cyclin B) causes a remarkable change in protein phosphorylation. Activation of CDK1:cyclin B is regulated by two auto-amplification loops-CDK1:cyclin B activates Cdc25, its own activating phosphatase, and inhibits Wee1, its own inhibiting kinase. Recent biological evidence has revealed that the inhibition of its counteracting phosphatase activity also occurs, and it is parallel to CDK1:cyclin B activation during mitosis. Phosphatase regulation of mitotic kinases and their substrates is essential to ensure that the progression of the cell cycle is ordered. Outlining how the mutual control of kinases and phosphatases governs the localization and timing of cell division will give us a new understanding about cell cycle regulation.
Ma, Chaobing;Zu, Xueyin;Liu, Kangdong;Bode, Ann M.;Dong, Zigang;Liu, Zhenzhen;Kim, Dong Joon
Molecules and Cells
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제42권9호
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pp.628-636
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2019
Altered genetic features in cancer cells lead to a high rate of aerobic glycolysis and metabolic reprogramming that is essential for increased cancer cell viability and rapid proliferation. Pyruvate kinase muscle (PKM) is a rate-limiting enzyme in the final step of glycolysis. Herein, we report that PKM is a potential therapeutic target in triple-negative breast cancer (TNBC) cells. We found that PKM1 or PKM2 is highly expressed in TNBC tissues or cells. Knockdown of PKM significantly suppressed cell proliferation and migration, and strongly reduced S phase and induced G2 phase cell cycle arrest by reducing phosphorylation of the CDC2 protein in TNBC cells. Additionally, knockdown of PKM significantly suppressed $NF-{\kappa}B$ (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) activity by reducing the phosphorylation of p65 at serine 536, and also decreased the expression of $NF-{\kappa}B$ target genes. Taken together, PKM is a potential target that may have therapeutic implications for TNBC cells.
Cordycepin은 Cordyceps militaris에서 처음 유래된 nucleoside adenosine 유도체의 일종으로 면역증강 및 항암활성을 포함한 다양한 약리 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 LNCap 인체 전립선 암세포 모델을 이용하여 cordycepin에 의한 항암활성 기전을 연구하였다. Cordycepin 처리에 따라 LNCap 세포는 처리 농도 의존적으로 증식이 억제되었으며, 이는 apoptosis 유발과 연관성이 있음을 poly ADP-ribose polymerase의 단편화 현상과 Annexin V 염색에 의한 정량적 분석으로 확인하였다. Cordycepin 처리에 따른 flow cytometric analysis 결과로서 cordycepin이 세포주기 G2/M기 정체 현상을 유발하였음을 알 수 있었으며, 이는 cyclin B1 및 cyclin A의 발현 감소와 연관성이 있었다. 또한 cordycepin이 처리된 LNCap 세포에서 cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor p21Waf1/Cip1의 발현이 증가되었지만, CDK2, CDC2 및 Cdc25C의 발현에는 큰 영향을 미치지 않았으며, cordycepin에 의하여 증가된 p21 단백질은 CDK2 및 CDC2와의 복합체를 형성하고 있었다. 본 연구의 결과는 LNCap 전립선 암세포에서 cordycepin에 의한 G2/M 및 apoptosis 유발은 p53 비존적인 CDK inhibitor p21의 발현 증가가 중요한 역할을 하고 있음을 보여주는 것이다.
본 연구에서는 인체 대장암세포인 HT29를 사용하여 포황 메탄올 추출물(Methanol extract of Typha orientalis, METO)의 항암 활성 및 그 분자적 기전에 관하여 분석하였다. 먼저 METO가 다양한 암세포의 증식에 미치는 영향을 분석한 결과, 인체 대장암 세포, 폐암 세포, 간암 세포 등의 세포증식을 억제하였으며 그 중에서도 대장암 세포인 HT29에 대해 강한 세포 증식 억제 효과를 나타내었다. METO에 의한 세포 증식 억제 기전을 분석하기 위하여 Flow cytometry analysis를 수행한 결과, METO 농도의존적으로 HT29 세포의 G2/M기 세포분포가 증가하고 아울러 apoptosis 유발군인 SubG1기 세포분포가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. METO에 의한 HT29 세포의 G2/M arrest는 Cdc2의 inactive form인 phospho-Cdc2의 증가에 의한 G2/M checkpoint 관련 단백질의 활성억제에 의한 것이라 사료된다. 이러한 phospho-Cdc2의 증가는 METO에 의해 발현이 증가된 Wee1 kinase와 발현이 감소된 Cdc25C phosphatase에 의해 야기된 것임을 확인하였다. 또한 METO에 의한 HT29의 apoptosis 유도에 관한 분자적 기전 분석을 위해 Western blot analysis를 수행한 결과, METO 농도가 증가할수록 종양 억제 유전자인 p53, death receptor인 FAS, Bcl-2 family 중 pro-apoptotic 단백질인 Bax 및 cytosolic cytochrome C의 발현이 증가되고, Caspase-3가 활성화되어 단편화된 Caspase-3의 증가가 관찰되었다. 또한 활성화된 Caspase-3의 기질 단백질인 PARP의 단편화가 일어나 apoptosis가 유도되는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과들로부터 METO는 인체 대장암세포 HT29의 G2/M arrest 및 apoptosis 유도에 의한 항암활성을 보유함을 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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