• KSBB Journal
• /
• 제21권2호
• /
• pp.133-139
• /
• 2006

혈액 내 순환시 안정성 향상과 면역원성의 감소를 위해, rhIFN-${\alpha}$-2a은 N-terminus의 ${\alpha}$-아민기에 mPEG aldehyde를 solid-phase PEGylation 시킨다. CM-Sepharose와 같은 양이온 교환수지가 고체 지지체로 사용되었다. Mono-PEGylate는 양이온 교환 수지에서 unmodified 단백질과 분리되어 용출된다. Site-srecific PEGylation과 mono-PEGylate의 분리가 한 단계의 공정으로 얻어진다는 점은 solid-phase PEGylation의 이점을 뒷받침해준다. 위치 특이성은 peptide digest의 질량 분석과 Edman degradation을 이용한 N-terminal sequencing에 의해 확인하였다. Mono-PEGylate는 항바이러스 활성과 면역원성의 감소를 나타내고, 감소 정도는 결합되는 mPEG의 분자량에 비례한다. Trypsin 저항성과 온도 안정성은 mono-PEGylation에 의해 두드러지게 개선되었다. Solid-phase PEGylation을 통해 종래의 액상 반응에서 나타날 수 있는 재현성 낮은 반응, 부 반응물 생성, 부 반응물 제거 공정 등의 단점을 극복할 수 있었다. 그러나 solid-phase PEGylation의 문제점인 액상 반응에 비교하여 많은 양의 PEG를 사용하여야 한다는 점은 개선되어야 한다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제16권10호
• /
• pp.1583-1590
• /
• 2006

T4 endonuclease V (T4 endo V) [EC 3. 1. 25. 1], found in bacteriophage T4, is responsible for excision repair of damaged DNA. The enzyme possesses two activities: a cyclobutane pyrimidine dimer DNA glycosylase (CPD glycosylase) and an apyrimidic/apurinic endonuclease (AP lyase). T4 denV (414 bp cDNA) encoding T4 en do V (138 amino acid) was synthesized and expressed using either an expression vector, pTriEx-4, in E. coli or a baculovirus AcNPV vector, pBacPAK8, in insect cells. The recombinant His-Tag/T4 endo V (rHis-Tag/T4 endo V) protein expressed from bacteria was purified using one-step affinity chromatography with a HiTrap Chelating HP column and used to make rabbit anti-His-Tag/T4 endo V polyclonal antibody for detection of recombinant T4 endo V (rT4 endo V) expressed in insect cells. In the meantime, the recombinant baculovirus was obtained by cotransfection of BacPAK6 viral DNA and pBP/T4 endo V in Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells, and used to infect Sf21 cells to overexpress T4 endo V protein. The level of rT4 endo V protein expressed in Sf21 cells was optimized by varying the virus titers and time course of infection. The optimal expression condition was set as follows; infection of the cells at a MOI of 10 and harvest at 96 h post-infection. Under these conditions, we estimated the amount of rT4 endo V produced in the baculovirus expression vector system to be 125 mg/l. The rT4 endo V was purified to homogeneity by a rapid procedure, consisting of ion-exchange, affinity, and reversed phase chromatographies, based on FPLC. The rT4 endo V positively reacted to an antiserum made against rHis-Tag/T4 endo V and showed a residual nicking activity against CPD-containing DNA caused by UV. This is the first report to have T4 endo V expressed in an insect system to exclude the toxic effect of a bacterial expression system, retaining enzymatic activity.

• 생명과학회지
• /
• 제25권7호
• /
• pp.801-809
• /
• 2015

활성화된 단핵구의 동형성 세포 부착(동형성 응집)은 염증반응, 분화, 이동과 같은 생리학적, 병리학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 매실 추출물은 항바이러스, 항균, 항암작용과 같은 효과를 보인다고 알려 져있다. 따라서, 매실 추출물은 단핵구의 동형성 응집 억제를 통해 염증반응을 조절할 가능성을 가진다. 본 연구에서는, 염증성 질환에서 매실 추출물의 치료효능을 뒷받침할 수 있는 분자적 기전을 조사하였다. 매실 추출물이 지질다당질(LPS)로 활성화된 단핵구의 동형성 응집을 억제함을 확인하였다. 이러한 효과는 LPS로 활성화된 THP-1 세포의 iNOS 단백질 발현 억제를 통해, 산화질소(NO) 생산의 감소로 조절되는 것을 발견하였다. 또한 NO 생성물질인 SNAP 처리 실험을 통해 단핵구 동형성 응집을 억제하는데 매실에 의한 NO 억제가 필수적인 기작임을 확인하였다. 게다가, 매실 추출물은 LPS로 유도된 IκB-α 의 인산화와 NF-κB의 핵내로의 이동을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다. 매실 추출물은 NO생성과 NF-κB 활성 억제를 통해 LPS로 활성화된 단핵구의 동형성 응집을 저해하고 이를 통해 항염증 효과를 유도할 수 있다는 결론으로부터 만성 염증성 질환의 치료와 예방에 매실 추출물의 효능을 제시하고자 한다.