• 미생물학회지
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• 제54권4호
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• pp.330-342
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• 2018

Streptavidin (STR)과 Biotin system은 Biotin의 Streptavidin에 대한 높은 비공유 친화력(non-covalent affinity; $K_D=10^{-14}M$)과 4 Biotin 결합부위를 갖는 Streptavidin의 tetramer 구조로 인해 복수의 항원결합부위 및 복수의 항원특이성을 갖는 항체를 제조할 수 있기 때문에 가장 활발하게 연구되고 있다. 이 system을 활용하기 위해 우리는 Streptomyces avidinii 염색체 DNA로부터 PCR을 통해 Streptavidin (STR) 유전자를 증폭하고 이를 TRAIL (tumor necrosis factor ${\alpha}$ related apoptosis induced ligand) receptor인 death receptor 4 (DR4)에 특이적으로 결합하는 hAY4 single-chain Fv 항체유전자에 융합시켰다. 대장균에서 발현시킨 STR에 융합된 hAY4 ScFv (hAY4-STR) 항체는 가열시킨 SDS-PAGE에서 43 kDa monomer를 나타내었다. 그러나 가열하지 않은 SDS-PAGE와 Size-exclusion chromatography에서는 tetramer인 172 kDa을 나타내었는데 이는 hAY4 ScFv-STR 항체가 STR의 자연적인 비공유결합에 의해 유도된 tetramer를 형성하고 있음을 나타내고 있다. 본 융합 단백질은 Ouchterlony assay와 ELISA에서 보여주는 것처럼 자연 Streptavidin과 유사한 Biotin 결합력을 유지하고 있었다. ELISA와 Westernblot을 이용하여 정제된 hAY4-STR 융합항체의 DR4 항원결합력 또한 확인하였다. 게다가 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 분석에서 hAY4 ScFv-STR tetramer는 tetramerization에 의해 hAY4 ScFv monomer보다 60배 더 높은 항원결합력을 나타내었다. 요약하면 hAY4 ScFv-STR 융합단백질은 E. coli에서 soluble tetramer로 성공적으로 발현 및 정제되었으며 Biotin과 DR4 항원에 동시에 결합함을 보여 주었다. 이는 bifunctional and tetrameric ScFv 항체를 제조 할 수 있음을 제시해 주고 있다.

• Journal of Acupuncture Research
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• 제22권3호
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• pp.169-183
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• 2005

Cobrotoxin의 항암효과를 알아보고자 암세포인 PC-3 cell에 cobrotoxin을 처리한 후 cell viability, cell death, apoptosis, cell cycle 및 관련단백질, Adk, 및 MAP kinase 관련 단백질의 변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. PC-3 세포에 각각 cobrotoxin을 각각 0-16 nM까지 투여시 대조군에 비하여 모두 농도 의존적으로 세포들의 모양이 길죽한 나선형 모양에서 둥글게 응축되는 모습으로 변하였으며 고농도로 갈수록 세포들의 성장이 억제를 보였다. 2. MTT assay를 이용하여 세포 생존력을 측정 한 결과, 0.1, 1 및 4nM의 cobrotoxin 처리군은 정상군에 비하여 세포활성의 감소를 나타내었고, 8, 16nM의 cobrotoxin 처리군은 정상군에 비하여 세포활성의 유의한 감소를 보였다. 3. PC3-cell에 cobrotoxin을 처리한후 FACS analysis를 통하여 세포주기를 측정한 결과 세포주기 중 S phase에서 0.0lnM cobrotoxin 처리군은 변함이 없지만, 1, 2, 4, 8 및 16 nM 의 cobrotoxin 처리군에서는 정상군에 비해 감소를 보였다. G2-M phase에서 0.1, 1, 2, 4, 8 및 16M의 cobrotoxin 처리군에서 정상군 에 비하여 증가를 보였다. 4. Cobrotoxin 처리후 Cox-2의 발현을 48시간 관찰한 결과 12시간에서 최대치를 이루었고, 6, 12 및 24시간후에서 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다. 5. G1 phase에서 활성을 이루는 Cdk4, cyclin Dl의 발현을 살펴본 결과 Cdk4는 cobrotoxin 1, 2, 4 및 8nM 처리군에서 정상군에 비하여 농도 의존적으로 감소하였고, cobrotoxin 4, 8nM 처리군은 정상군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다. Cyclin Dl은 cobrotoxin 1, 2, 4 및 8nM 처리 군에서 정상군에 비하여 농도 의존적으로 감소하였다. Cycline E는 cobrotoxin 1, 2, 4 및 8nM 처리 군에서 정상군에 비해 큰 변화가 없었다. G2/M phase에 관여하는 단백질인 Cyclin Bl 은 cobrotoxin 1, 2, 4 및 8nM 처리군에서 정상군에 비하여 농도 의존적으로 감소하였고, cobrotoxin 2, 4, 8M 처리군은 정상군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다. 6. 세포성장 단백질인 Akt의 발현을 살펴본 결과 1, 2, 4 및 8nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비하여 농도 의존적으로 감소하였고, 4, 8nM친 cobrotoxln 처리군은 정상에 비하여 유의한 감소를 나타내었다. 7. MAP kinase에 관여하는 단백질인 ERK, p-ERK, JNK, p-JNK p38, p-p38에 미치는 영향을 살펴본 결과, ERK은 1, 2nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비하여 증가를, 4, 8nM의 cobrotokin 처리군에서 정상군에 비하여 감소를 나타내었다. p-ERK은 1, 2, 4nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비하여 증가를, 8nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비하여 감소를 나타내었다. JNK와 p-JNK는 1, 2, 4 및 8nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비하여 증가를 나타내었다. p38는 1, 4, 8nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비하여 감소를, 2nM의 cobrotoxin 처리군에서는 정상군에 비하여 감소를 나타내었다. p-p38는 1nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비하여 증가를, 2, 4, 8nM의 cobrotoxin 처리군에서는 정상군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다. 8. PC 3-cells 성장의 억제 역시 세포사멸을 유도한 세포성장억제 인지를 알아보기 위해 DAPI staining을 통한 세포의 핵을 염색하여 그 모양을 관찰한 결과, 정상세포가 동글동글 하고 균일한데 비하여 세포사멸이 일어난 세 포는 핵이 응축되고, 여러 조각으로 나뉜 모습을 관찰할 수 있었다. 또한, 세포사멸을 살펴본 결과 1, 2, 4, 8 및 16nM cobrotoxin 처 8nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비하여 유의한 변동을 나타내지 않았다. Bcl-2 는 1, 2, 4 및 8nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비해 농도 의존적으로 유의한 감소를 나타내었다. 9. 세포사멸 관련 유전자인 caspase family (caspase 3, 9)와 Bcl-2 family (Bcl-2, Bax), p53의 발현을 살펴본 결과, Bax는 1, 2, 4 및 Caspase 3과 9는 1, 2, 4nM의 cobrotoxin 처리군에서 정상군에 비하여 유의한 변동을 나타내지 않았으나, 8nM cobrotoxin 처리군에서는 유의한 감소를 나타내었다. 이상의 결과를 종합해보면, 일정수준(pico 또는 namo molar 수준)의 cobrotoxin이 prostate cancer cell의 성장을 억제하고, 세포사멸을 유도 하여 항암 효과가 있음을 확인할 수 있었으며 향후 cobrotoxin의 항암 효과를 실제 임상에 활용할 수 있게 되기를 기대한다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제46권6호
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• pp.759-764
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• 2017

당뇨합병증에 효과적인 천연물 유래의 신소재를 개발하기 위하여 본 연구를 수행하여 단풍취 70% 에탄올 추출물의 EtOAc 가용부로부터 최종당화산물 생성 억제능($IC_{50}=5.5{\pm}1.1{\mu}g/mL$)을 확인하였다. 활성을 나타내는 성분의 동정을 위하여 $C_{18}$겔 등을 활용한 칼럼크로마토그래피를 수행하여 4종의 dicaffeoylquinic acid 유도체 화합물을 분리하였고, 각 화합물의 화학구조는 NMR 스펙트럼 데이터 해석 및 표품과의 HPLC 직접 비교를 통하여 methyl 3,5-di-O-caffeoyl-epi-quinate(1), 3,5-di-O-caffeoyl-epi-quinic acid(2), 4,5-di-O-caffeoyl-quinic acid(3) 및 methyl 4,5-di-O-caffeoyl-quinate(4)로 동정하였다. 이들 화합물에 대해 최종당화산물 생성 억제능을 평가한 결과 4,5-di-O-caffeoyl-quinic acid(3)가 가장 강한 $0.4{\pm}0.1{\mu}M$의 $IC_{50}$ 값을 나타내었으며, 3,5-di-O-caffeoyl-epi-quinic acid(2)가 $0.6{\pm}0.1{\mu}M$의 $IC_{50}$ 값을 나타내었다. 또한, 이들 물질에 대해 $ABTS^+$ 소거 활성을 평가하여 4,5-di-O-caffeoyl-quinic acid(3)가 가장 강한 라디칼 소거 활성인 $14.6{\pm}0.4{\mu}M$의 $IC_{50}$ 값을 나타내었으며, 구조 이성질체인 3,5-di-O-caffeoyl-epi-quinic acid(2)가 $18.8{\pm}0.4{\mu}M$의 $IC_{50}$ 값을 확인하였다. 단풍취에서 분리한 화합물의 활성은 caffeic acid의 결합방식 및 methyl화 여부에 따른 화합물의 구조에 따라 다름이 시사되었다. 향후 우수한 활성을 나타낸 이들 화합물의 in vivo 실험을 통한 활성기작의 검증이 필요하다고 생각된다. 또한, 추가적인 연구를 통하여 식의약 소재로 활용이 가능한 새로운 천연신소재 발굴을 위한 기초자료제공 및 당뇨합병증에 효과적인 천연 물질의 상업화를 위한 귀중한 자료로 활용할 수 있으리라 판단된다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제46권1호
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• pp.46-55
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• 2017

본 연구에서는 한약재의 장기보존을 위한 위생처리법으로 잘 알려진 감마선 조사 처리 시 독활 추출물의 항산화 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 천연 약용식물인 독활의 감마선 조사 처리에 따른 조사 판별 marker 확인을 위해 광자극발광법, 열발광분석법, 전자스핀공명법을 이용하여 확인시험법의 판별 특성을 확인하였다. 그 결과 광자극발광법에서 비조사구 0 kGy에서 891.00 PCs의 중간시료 수치를 나타내어 광자극발광법 단독으로는 조사 여부 판별 확인이 어려운 것을 확인할 수 있었다. 하지만 열발광분석법, 전자스핀 공명법에서는 조사구와 비조사구 간의 차이를 명확히 확인할 수 있었으며, 이를 통해 한약재인 독활은 3가지 확인 시험법을 모두 적용하여 분석하는 것이 적합한 것으로 판단되었다. 에탄올 농도별 추출에서는 50% 에탄올에서 비조사구 0 kGy와 조사구 10 kGy에서 각각 5.98 mg/g, 6.86 mg/g의 함량을 나타내었다. 항산화 활성 확인을 위해 추출물의 phenolic 농도를 $50{\sim}200{\mu}g/mL$로 조절하여 DPPH radical 소거 효과를 측정한 결과 열수와 50% 에탄올 추출물의 비조사구 0 kGy와 조사구 10 kGy $50{\sim}200{\mu}g/mL$ phenolic 농도 전 구간에서 84.04~100.00%의 매우 높은 소거효과를 나타내었으나, 감마선 조사 처리에 따른 유의적인 차이는 없었다. ABTS radical 소거 활성 측정 결과 열수와 50% 에탄올 추출물의 비조사구 0 kGy와 조사구 10 kGy $200{\mu}g/mL$ phenolic 농도에서 95% 이상의 높은 소거 효과를 나타내었다. Antioxidant protection factor(PF) 측정 결과 $100{\mu}g/mL$ phenolic 농도 처리 시 열수 추출물 비조사구 0 kGy와 조사구 10 kGy에서 각각 2.51 PF, 2.01 PF, 50% 에탄올 추출물 비조사구 0 kGy와 조사구 10 kGy는 각각 1.38 PF, 1.48 PF를 나타내었다. TBARs 저해 효과는 $50{\sim}200{\mu}g/mL$ phenolic 농도 전 구간에서 열수 추출물 비조사구 0 kGy와 조사구 10 kGy에서 65.23~83.10%를 나타냈으며, 50% 에탄올 추출물 비조사구 0 kGy와 조사구 10 kGy에서 70.67~95.81%로 농도 의존적으로 증가하는 양상을 나타냈다. 본 연구 결과 감마선 조사 처리에 따른 total phenolic compounds 함량은 열수 추출물의 경우 조사 처리 후 함량이 감소하였고, 50% 에탄올 추출물의 경우 조사 처리 후 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 독활의 장기저장을 위해 처리한 감마선 조사 전과 후 독활 추출물의 항산화 활성 변화에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 보이며 이는 감마선 조사법이 독활을 포함한 한약재의 장기저장을 위한 처리법으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

• Journal of Acupuncture Research
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• 제22권3호
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• pp.155-167
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• 2005

Cobrotoxin의 항염증 치료 기전에 대해 연구하기 위하여 성상세포에 LPS 및 SNP로 염증을 유도한 후 NF-${\kappa}B$와 DNA의 결합 능력, NF-kB Dependent Luciferase 발현, Astrocyte의 세포활성, NF-${\kappa}B$ 구성 단백질인 P50, P-$1{\kappa}B$, $1{\kappa}BB$ 및 염증(炎症)관련 유전자(遺傳子)인 Cox-2, iNOS, cPLA2의 발현과 GSH와 DTT로 sulf-hydryl기를 환원시 NF-${\kappa}B$와 DNA의 결합 능력, NF-${\kappa}B$ 구성 단백질인 P50 발현에 미치는 영향과 Cobrotoxin의 성상세포 내 유입 등을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. LPS 로 염증을 유발한 후 NF-${\kappa}B$와 DNA의 결합 능력을 관찰한 결과 Cobrotoxin 0.1${\mu}g/m{\ell}$ 처리군, Astrocyte 내에서의 Cobrotoxin 0.1, 0.5${\mu}g/m{\ell}$ 처리군에서 모두 대조군에 비하여 유의한 억제를 나타내었다. 2. LPS로 염증을 유발한 후 Astrocyte 내에서 NF-${\kappa}B$ Dependent Luciferase 발현을 살펴본 결과 Cobrotoxin 모든 처리군에서 대조군에 비하여 유의한 억제를 나타내었다. 3. SNP로 염증을 유발한 후 Cobrotoxin이 NF-${\kappa}B$ 구성 단백질인 P50, P-$1{\kappa}B$, $1{\kappa}B$ 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 P50와 $1{\kappa}B$는 Cobrotoxin 0.1, 0.5 및 $1{\mu}g/m{\ell}$ 모든 처리군에서 대조군에 비하여 유의한 억제를 나타내었고, P-$1{\kappa}B$는 Cobrotoxin $0.1{\mu}g/m{\ell}$ 처리군에서 대조군에 비하여 억제를, Cobrotoxin 0.5, $1{\mu}g/m{\ell}$ 처리군에서 각각 대조군에 비하여 유의한 억제를 나타내었다. 4. LPS로 염증을 유발한 후 Cobrotoxin이 NF-${\kappa}B$ 구성 단백질인 P50, P-$1{\kappa}B$, $1{\kappa}B$ 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 P50와 $1{\kappa}B$는 Cobrotoxin 0.5, $1{\mu}g/m{\ell}$ 처리군에서 각각 대조군에 비하여 유의한 억제를 나타내었다. 5. SNP로 염증을 유발한 후 Cobrotoxin이 염증(炎症) 관련 유전자(遺傳子)인 Cox-2, iNOS, cPLA2 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 Cox-2, iNOS, cPLA2 모두 Cobrotoxin $1{\mu}g/m{\ell}$ 처리군에서 대조군에 비하여 유의한 억제를 나타내었다. 6. LPS로 염증을 유발한 후 Cobrotoxin이 염증(炎症) 관련 견전자(遣傳子)인 Cox-2, iNOS, cPLA2 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 Cox-2와 cPLA2의 경우 Cobrotoxin 0.1, 0.5 및 $1{\mu}g/m{\ell}$ 모든 처리군에서, iNOS의 경우 Cobrotoxin 0.5, $1{\mu}g/m{\ell}$ 처리군에서 대조군에 비하여 유의한 억제를 나타내었다. 7. Astrocyte내에서 SNP로 염증을 유발한 후 GSH와 DTT로 sulf-hydryl기를 환원하여 NF-${\kappa}B$와 BNA의 결합 능력을 관찰한 결과 Cobrotoxin $0.5{\mu}g/m{\ell}$과 DTT 1mM Cobrotoxin $0.5{\mu}g/m{\ell}$과 DTT 5mM의 동시처리군은 각각 Cobrotoxin $0.5{\mu}g/m{\ell}$ 처리군에 비하여 유의한 증가를 나타내었다. 8. Astrocyte 내에서 LPS로 염증을 유발한 후 GSH와 DTT로 sulf-hydryl기를 환원하여 NF-${\kappa}B$와 DNA의 결합 능력을 관찰한 결과 cobrotoxin $0.5{\mu}g/m{\ell}$과 DTT 1mM Cobrotoxin $0.5{\mu}g/m{\ell}$과 DTT 5mM의 동시처리군과 Cobrotoxin $0.5{\mu}g/m{\ell}$과 GSH 1mM Cobrotoxin $0.5{\mu}g/m{\ell}$과 GSH 5mM의 동시처리군 모두에서 Cobrotoxin $0.5{\mu}g/m{\ell}$ 처리군에 비하여 유의한 증가를 나타내었다. 9. Astrocyte 내에서 SNP로 염증을 유발한 후 GSH와 DTT로 sulf-hydryl기 환원시 NF-${\kappa}B$ 구성 단백질인 P50 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과 SNP, Cobrotoxin $1{\mu}g/m{\ell}$와 DTT 1 또는 5mM 동시처리군과 SNP, Cobrotoxin $1{\mu}g/m{\ell}$와 GSH 1 또는 5mM 동시처리군 모두에서 Cobrotoxin $1{\mu}g/m{\ell}$ 처리군에 비하여 발현의 유의한 증가를 나타내었다. 10. Cobrotoxin의 세포 내 유입 확인을 살펴본 결과 Astrocyte 내에서 Cobrotoxin이 세포내로 유입되는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 보아 Cobrotoxin 처리는 성상 세포 들을 대상을 LPS 및 SNP로 유도된 NF-${\kappa}B$ 관련 염증 기전과 iNOS, COX-2, cPLA2와 같은 염증관련 유전자의 발현 및 NO, PGE2,에 유의한 변동을 나타내었고, 이들 결과는 Cobrotoxin의 항염증 효과 및 그 치료기전에 대하여 입증한 것이며, 향후 안전성 연구를 바탕으로 신경계 및 심혈관계 염증치료에 약침개발과 같은 적극적인 활용이 기대된다.