• 제목/요약/키워드: Wild type and mutants

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OsDOR1, a novel glycine rich protein that regulates rice seed dormancy

  • Kim, Suyeon;Huh, Sun Mi;Han, Hay Ju;Cho, Mi Hyun;Lee, Gang Sub;Kim, Beom Gi;Kwon, Taek Yun;Yoon, In Sun
    • 한국작물학회:학술대회논문집
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    • 한국작물학회 2017년도 9th Asian Crop Science Association conference
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    • pp.90-90
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    • 2017
  • Regulation of seed dormancy is important in many grains to prevent pre-harvest sprouting. To identify and understand the gene related to seed dormancy regulation, we have screened for viviparous phenotypes of rice mutant lines generated by insertion of Ds transposon in a Korean Japonica cultivar (Dongjin) background. One of the mutants, which represented viviparous phenotype, was selected for further seed dormancy regulation studies and designated dor1. The dor1 mutant has single Ds insertion in the second exon of OsDor1 gene encoding glycine-rich protein. The seeds of dor1 mutant showed a higher germination potential and reduced abscisic acid (ABA) sensitivity compared to wild type Dongjin. Over-expression of Dor1 complements the viviparous phenotype of dor1 mutant, indicating that Dor1 function in seed dormancy regulation. Subcellular localization assay of Dor1-GFP fusion protein revealed that the OsDor1 protein mainly localized to membrane and the localization of OsDOR1 was influenced by presence of a giberelin (GA) receptor OsGID1. Further bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis indicated that OsDOR1 interact with OsGID1. The combined results suggested that OsDOR1 regulates seed dormancy by interacting with OsGID1 in GA response. Additionally, expression of OsDOR1 partially complemented the cold sensitivity of Escherichia coli BX04 mutant lacking four cold shock proteins, indicating that OsDOR1 possessed RNA chaperone activity.

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방선균 항생제 고생산 산업균주를 기반으로 한 모델 폴리케타이드의 이종숙주 발현 (Heterologous Expression of a Model Polyketide Pathway in Doxorubicin-overproducing Streptomyces Industrial Mutants)

  • 김혜진;이한나;김응수
    • 한국미생물·생명공학회지
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    • 제40권1호
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    • pp.10-16
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    • 2012
  • 방선균 Streptomyces peucetius OIM ($\underline{O}$verproducing $\underline{I}$ndustrial $\underline{M}$utant)은 반복적인 돌연변이를 통하여 폴리케타이드 항생제인 독소루비신(DXR)의 생산성이 최적화 된 고생산성 산업균주이다. 이 S. peucetius OIM 변이종을 대리의 숙주로 이용하여, 생합경로 크기가 작은 모델 폴리케타이드인 알로에사포나린 II(액티노로딘의 합성경로 유도체)의 생합성 유전자군을 고복제수 플라스미드에 클로닝하여 알로에사포나린 II의 기능적 발현을 확인하여 정량분석을 수행하였다. OIM 균주의 알로에사포나린 II의 생산량은 조절 네트워크가 극대화된 S. coelicolor 변이종 뿐만 아니라 야생형S. peucetius 보다 매우 높은 수준으로 생산되는 것으로 확인되었다. 또한 알로에사포나린 II의 생산 수준은 다운-조절자 $wblA_{spe}$가 제거된 S. peucetius OIM 균주에서 가장 높은것으로 측정되었으며, 이는 합리적으로 유전체를 재설계한 S. peucetius OIM 변이종 균주가 이종의 폴리케타이드 생합성을 높은 수준으로 발현할 수 있는 대리의 숙주로서 충분히 활용 가능함을 보여준다.

커넥신 세포막채널을 이용한 씨엠티엑스 돌연변이체의 분석 (Analysis of CMTX Mutants Using Connexin Membrane Channels)

  • 천미색;오승훈
    • 생명과학회지
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    • 제18권6호
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    • pp.764-769
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    • 2008
  • 커넥신(connexin) 32 유전자의 돌연변이가 씨엠티엑스(CMTX, X-linked Charcot-Marie-Tooth) 질환과 관련이 있다. 현재까지 300여개 이상의 돌연변이가 보고가 되었으나 이 질환에 대한 상세한 분자병리학적 원인을 거의 알려져 있지 않고 있다. 여러 연구를 통해서 커넥신 세포막채널이 간극결합채널이 갖고 있는 대부분의 생물리학적 특성을 갖고 있는 것으로 판명되었다. 이번 연구에서는 씨엠티엑스 질환과 관련된 두 개의 돌연변이체를 선정하여 간극결합채녈 대신 돌연변이체로 구성된 커넥신 세포막채널을 이용하여 단일채널수준에서 이들 돌연변이체의 특성을 조사하였다. M34T 돌연변이 세포막채널의 생물리학적 특성은 이들로 구성된 돌연변이 간극결합채널의 특성과 거의 유사하였다. 더욱이, 돌연변이 세포막채널을 이용한 연구를 통해서 간극결합채널을 이용한 연구에서는 밝혀지지 않았던 개폐극성의 역전, 빠른 개폐의 소실과 느린 개폐의 생성과 같은 새로운 사실을 알게 되었다. T86C 돌연변이 세포막채널 또한 이의 모체가 되는 커넥신 32 세포막채널과 유사한 특성을 갖고 있음을 알게 되었다. 이상의 결과를 통해서 커넥신 세포막을 이용한 연구가 씨엠티엑스 질환의 돌연변이체를 연구하는데 매우 유용할 것으로 생각된다.

배양온도 변화에 따른 Streptomyces viridochromogenes의 지질과 지방산 조성변화 (Changes in Lipids- and Fatty Acids Compositions in Response to Growth Temperature of Streptomyces viridochromogenes)

  • 김재헌;김우상
    • 미생물학회지
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    • 제39권3호
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    • pp.155-160
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    • 2003
  • Streptomyces viridochromogenes 야생형과 기중균사 형성 변이주들의 지질과 지방산의 조성을 배양온도와 배양시간에 따라 조사하였다. Triacylglycerol은 기중균사가 형성되는 경우에만 감소되어 기중균사 형성과 연관되어 있음을 나타내었다. 인지질의 경우에는 배양조건에 따른 특이적 변화를 볼 수 없었으나, 기중균사 형성능이 상실된 변이주 BR2가 $20^{\circ}C$에서 배양되었을 매 phosphatidylethanolamine 조성이 특이하게 높게 나타났다. 그리고 변이주 BR2는$20^{\circ}C$$30^{\circ}C$ 배양 시 다양한 $R_{f}$ 간의 동정되지 않은 아미노지질들을 함유하였다. 모든 균주에서 아미노지질의 일종인 ornithinolipid는 배양시간이 경과되면서 증가되는 경향을 나타내었다. 지방산조성은 온도에 민감하여 배양온도가 높을수록 불포화지방산 함량이 낮아졌다. 기중균사 형성은 직쇄형 포화지방산의 함량 감소를 수반하였으며, 기중균사 생성능이 우수한 변이주 M13은 배양초기의 직쇄형 포화지방산 함량이 가장 높았다. 변이주 BR2는 iso형 홀수탄소 지방산의 함량이 특이적으로 높았다.

Neurospora crassa 유전자에 의한 Saccharomyces cerevisiae coq7 돌연변이의 회복 (Restoration of Saccharomyces cerevisiae coq7 Mutant by a Neurospora crassa Gene)

  • 김은정;김상래;이병욱
    • 생명과학회지
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    • 제13권6호
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    • pp.933-942
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    • 2003
  • Coenzyme Q은 긴 isoprenoid 사슬을 갖는 quinone의 유도체이다. Coenzyme Q는 진핵생명체의 미토콘드리아의 내막과 원핵생명체의 세포막에 위치하는 전자전달계에 존재하는 지용성 물질이며, 또한 항산화제로의 기능도 갖는다. Coenzyme Q는 Saccharomyces cerevisiae의 호기적 성장에 필수적이며, coq 돌연변이체는 발효가 불가능한 탄소 원에서의 성장이 불가능하다. S. cerevisiae의 $coq^7$p 효소들과 유사성을 나타내는 단백질을 암호화하는 Neurcspora crassa cDNA를 효모의 발현 벡터에 삽입하였다. N. crassa COQ7의 예상 서열은 S. cerevisiae의 효소와 58% homology를 보였다. N. crassa $coq^{-7}$ 유전자의 S. cerevisiae $coq^7$ 형질전환체는 야생형 균주와 유사한 성장률을 보였다. 형질전환 균주들은 발효가 불가능한 탄소원인 글리세롤을 유일한 탄소원으로 배양하였을 경우에도 정상적인 성장을 나타냈다. 또한 불포화지방산인 linolenic acid를 성장 배지에 첨가하여도 야생형 균주와 유사한 생존율이 관찰되었다.

Agrobacterium을 이용한 팽이 버섯 주름조직의 형질전환 (Agrobacterium-mediated transformation using gill tissue of Flammulina velutipes)

  • 박순영;;장갑열;신평균;박윤정;유영복;박기문;공원식
    • 한국균학회지
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    • 제38권1호
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    • pp.48-53
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    • 2010
  • 팽이버섯의 다양한 유전자의 기능을 연구하기 위한 방법으로 팽이 자실체의 주름조직을 사용하여 A. tumefaciens을 매개로 한 형질전환을 수행하였다. Hygromycin 항생제 저항성 유전자를 포함하고 있는 AGL-1 pBGgHg를 팽이버섯의 자실체 조직에 도입시킴으로서 형질전환체들을 얻을 수 있었다. 형질전환체 선발은 첫 번째로 hygromycin 선발 배지에서 선발한 뒤 gpd-FH, hph-R primer를 이용하여 PCR로 확인 할 수 있었다. hygromycin은 30 ug/ml에서 선발 효율이 가장 높았다. 형질전환체 중 일부는 갈색 자실체를 갖는 wild type과는 달리 백색 자실체를 나타내었다. 형질전환체의 southern blot결과 외래유전자가 팽이버섯 내부에 하나 또는 그 이상의 다양한 copy 수로 삽입되어 있음을 알 수 있었다. 또한 삽입된 유전자의 주변 염기서열에 대한 정보는 Inverse PCR을 통해 알 수 있었다.

인디고와 인디루빈의 생산을 증대하기 위한 플라빈-함유 모노옥시게나제의 단백질공학 (Protein Engineering of Flavin-containing Monooxygenase from Corynebacterium glutamicum for Improved Production of Indigo and Indirubin)

  • 정혜숙;정혜빈;김희숙;김창겸;이진호
    • 생명과학회지
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    • 제28권6호
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    • pp.656-662
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    • 2018
  • 향상된 인디고이드 생산능력을 갖는 코리네박테리움 유래의 변이 플라빈-함유 모노옥시게나제(cFMO)를 개발하기 위하여, cFMO 효소의 상동성모델을 이용하여 말토오스-결합단백질(MBP)과 융합된 4가지 변이체(F170Y, A210G, A210S, T326S)를 제작하고 그 생화학적 특징을 밝혔다. 정제된 MBP-T326S는 최적 활성을 위하여 야생형보다 고농도의 FAD ($100{\mu}M$)를 요구하며, $100{\mu}M$의 FAD 첨가조건에서 $k_{cat}/K_m$이 3.8배 증가되었다. 인돌 옥시게나제 활성은 야생형의 63-77%를 나타냈다. MBP-T326S는 기질이 존재하지 않을 경우 쓸모없는 NADPH 산화효소 활성이 매우 낮은 수준을 보여주었다(21-24%). T326S이외의 변이 단백질들은 야생형에 비하여 $K_m$은 비슷하며 $k_{cat}/K_m$은 증가하였다. MBP-F170Y와 -A210S 변이단백질은 인돌 옥시게나제 활성이 각각 3.1배, 2.9배 증가하였다. 2.5 g/l의 트립토판을 함유한 LB배지에서 인디고이드 생산을 시험했을 때, 야생형 cFMO를 함유한 대장균은 684 mg/l의 인디고와 104 mg/l의 인디루빈을 생산한 반면, T326S를 함유한 세포는 1,040 mg/l의 인디고와 112 mg/l의 인디루빈을 생산하였다. 이전의 결과인 Methylophaga 유래의 FMO를 발현하는 대장균에서 가장 높은 수준인 920 mg/l의 인디고를 생산한 것과 비교하면, 본 연구결과는 인디고 생산이 13% 높은 수준이였다. 상동성 모델링에 기반한 cFMO의 단백질공학은 인디고이드 생산균을 개발하는데 보다 더 논리적인 전략을 제시하였다.

들잔디 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase(EPSPS) 유전자 클로닝 및 특성 (Cloning and Characterization of a 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) Gene from Korean Lawn Grass (Zoysia japonica))

  • 이혜정;이긍주;김동섭;김진백;구자형;강시용
    • 원예과학기술지
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    • 제28권4호
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    • pp.648-655
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    • 2010
  • 본 연구에서는 들잔디와 돌연변이체에서 Glyphosate 내성 관련 유전자인 EPSPS를 코딩하는 cDNA를 분리하여, 시퀸스 비교분석과 발현 양상 차이 등에 관하여 조사하였다. 5'/3' RACE를 통하여 밝혀진 EPSPS의 cDNA는 각각 1176bp의 open reading frame으로 이루어져 있으며 391개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 이는 보고된 다른 EPSPS 유전자들과 높은 유사성을 가지고 있다. Genomic southern 결과 들잔디 내에 EPSPS 유전자는 단일copy로 존재하였다. Wild type과 제초제 내성 변이체의 EPSPS 유전자는 6개의 아미노산 시퀀스의 차이를 보였으며 기존에 보고된 EPSPS active site에서 시퀀스의 차이를 나타냈다. 한편 glyphosate의 독성기작의 하나인 EPSPS 효소활성 저해 작용을 알아본 결과, 내성 개체에서 높은(1.5배 이상) EPSPS 활성을 확인할 수 있었다. Northern 분석과 RT-PCR로 제초제 처리 시간에 따른 EPSPS의 발현량을 살펴본 결과, 제초제 처리 후 시간이 경과할수록 발현량이 증가하다가 7일 이후에는 감소하였고, wild type에 비해 glyphosate 내성 선발개체에서 전체적인 발현량이 높음을 알 수 있었다. 본 연구 결과 선발된 glyphosate 내성 돌연변이체는 높은 EPSPS 효소활성 증가 및 EPSPS active site의 아미노산 시퀀스 변화를 통해 원할하고 지속적인 방향족 아미노산의 합성이 가능한 것으로 보여졌다. 본 실험을 통해 얻어진 glyphosate 내성 잔디 돌연변이체와 방법은 앞으로 유용한 제초제 저항성 돌연변이 품종개발 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Requirement of β subunit for the reduced voltage-gated Na+ current of a Brugada syndrome patient having novel double missense mutation (p.A385T/R504T) of SCN5A

  • Na Kyeong Park;Seong Woo Choi;Soon-Jung Park;JooHan Woo;Hyun Jong Kim;Woo Kyung Kim;Sung-Hwan Moon;Hun-Jun Park;Sung Joon Kim
    • The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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    • 제28권4호
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    • pp.313-322
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    • 2024
  • Mutations within the SCN5A gene, which encodes the α-subunit 5 (NaV1.5) of the voltage-gated Na+ channel, have been linked to three distinct cardiac arrhythmia disorders: long QT syndrome type 3, Brugada syndrome (BrS), and cardiac conduction disorder. In this study, we have identified novel missense mutations (p.A385T/R504T) within SCN5A in a patient exhibiting overlap arrhythmia phenotypes. This study aims to elucidate the functional consequences of SCN5A mutants (p.A385T/R504T) to understand the clinical phenotypes. Whole-cell patch-clamp technique was used to analyze the NaV1.5 current (INa) in HEK293 cells transfected with the wild-type and mutant SCN5A with or without SCN1B co-expression. The amplitude of INa was not altered in mutant SCN5A (p.A385T/R504T) alone. Furthermore, a rightward shift of the voltage-dependent inactivation and faster recovery from inactivation was observed, suggesting a gain-of-function state. Intriguingly, the co-expression of SCN1B with p.A385T/R504T revealed significant reduction of INa and slower recovery from inactivation, consistent with the loss-of-function in Na+ channels. The SCN1B dependent reduction of INa was also observed in a single mutation p.R504T, but p.A385T co-expressed with SCN1B showed no reduction. In contrast, the slower recovery from inactivation with SCN1B was observed in A385T while not in R504T. The expression of SCN1B is indispensable for the electrophysiological phenotype of BrS with the novel double mutations; p.A385T and p.R504T contributed to the slower recovery from inactivation and reduced current density of NaV1.5, respectively.

Development of System-Wide Functional Analysis Platform for Pathogenicity Genes in Magnaporthe oryzae

  • Park, Sook-Young;Choi, Jaehyuk;Choi, Jaeyoung;Kim, Seongbeom;Jeon, Jongbum;Kwon, Seomun;Lee, Dayoung;Huh, Aram;Shin, Miho;Jung, Kyungyoung;Jeon, Junhyun;Kang, Chang Hyun;Kang, Seogchan;Lee, Yong-Hwan
    • 한국균학회소식:학술대회논문집
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    • 한국균학회 2014년도 추계학술대회 및 정기총회
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    • pp.9-9
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    • 2014
  • Null mutants generated by targeted gene replacement are frequently used to reveal function of the genes in fungi. However, targeted gene deletions may be difficult to obtain or it may not be applicable, such as in the case of redundant or lethal genes. Constitutive expression system could be an alternative to avoid these difficulties and to provide new platform in fungal functional genomics research. Here we developed a novel platform for functional analysis genes in Magnaporthe oryzae by constitutive expression under a strong promoter. Employing a binary vector (pGOF1), carrying $EF1{\beta}$ promoter, we generated a total of 4,432 transformants by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. We have analyzed a subset of 54 transformants that have the vector inserted in the promoter region of individual genes, at distances ranging from 44 to 1,479 bp. These transformants showed increased transcript levels of the genes that are found immediately adjacent to the vector, compared to those of wild type. Ten transformants showed higher levels of expression relative to the wild type not only in mycelial stage but also during infection-related development. Two transformants that T-DNA was inserted in the promotor regions of putative lethal genes, MoRPT4 and MoDBP5, showed decreased conidiation and pathogenicity, respectively. We also characterized two transformants that T-DNA was inserted in functionally redundant genes encoding alpha-glucosidase and alpha-mannosidase. These transformants also showed decreased mycelial growth and pathogenicity, implying successful application of this platform in functional analysis of the genes. Our data also demonstrated that comparative phenotypic analysis under over-expression and suppression of gene expression could prove a highly efficient system for functional analysis of the genes. Our over-expressed transformants library would be a valuable resource for functional characterization of the redundant or lethal genes in M. oryzae and this system may be applicable in other fungi.

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