• 한국독성학회:학술대회논문집
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• 한국독성학회 2005년도 춘계 국제심포지엄 및 학술대회
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• pp.151-151
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• 2005

• Molecules and Cells
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• 제43권6호
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• pp.517-529
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• 2020

Carboxyl-terminal binding proteins (CtBPs) are transcription regulators that control gene expression in multiple cellular processes. Our recent findings indicated that overexpression of CtBP2 caused the repression of multiple bone development and differentiation genes, resulting in atrophic nonunion. Therefore, disrupting the CtBP2-associated transcriptional complex with small molecules may be an effective strategy to prevent nonunion. In the present study, we developed an in vitro screening system in yeast cells to identify small molecules capable of disrupting the CtBP2-p300 interaction. Herein, we focus our studies on revealing the in vitro and in vivo effects of a small molecule NSM00158, which showed the strongest inhibition of the CtBP2-p300 interaction in vitro. Our results indicated that NSM00158 could specifically disrupt CtBP2 function and cause the disassociation of the CtBP2-p300-Runx2 complex. The impairment of this complex led to failed binding of Runx2 to its downstream targets, causing their upregulation. Using a mouse fracture model, we evaluated the in vivo effect of NSM00158 on preventing nonunion. Consistent with the in vitro results, the NSM00158 treatment resulted in the upregulation of Runx2 downstream targets. Importantly, we found that the administration of NSM00158 could prevent the occurrence of nonunion. Our results suggest that NSM00158 represents a new potential compound to prevent the occurrence of nonunion by disrupting CtBP2 function and impairing the assembly of the CtBP2-p300-Runx2 transcriptional complex.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제50권1호
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• pp.52-66
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• 2001

연구배경 : 폐상피세포가 능동적으로 IL-8을 분비한다는 것은 주지의 사실이다. NF-${\kappa}B$는 IL-8 발현 조절에 있어서 가장 중요한 역할을 담당하는 전사인자이다. Triptolide는 최근 밝혀진 NF-${\kappa}B$ 억제제로서 중국한약제인 뇌공등 (Tripterygium Wilfordii)에서 추출된약제이다. 연자들은 새로운 NF-${\kappa}B$ 억제제인 triptolide가 폐상피세포에서 NF-${\kappa}B$ 의존성 IL-8 유전자의triptolide가 염증성 폐질환에서 새로운 치료제로서의 가능성을 확인하기 위하여 본 연구를 시행하였다. 방법 : 폐상피세포로서 A549 사용하였고 triptolide는 미국의 Pharamagenesis(Palo Alto, CA)사로부터 제공받았다. NF-${\kappa}B$ 활성유도물질로는 IL-$1{\beta}$(R&D)와 PMA(Sigma)를 이용하였다. IL-8 유전자의 발현은 RT-PCR과 ELISA를 이용하여 측정 하였다. NF-${\kappa}B$의존성 IL-8 유전자의 전사활성을 평가하기 위하여는 IL-8 NF-${\kappa}B$ luciferase construct를 안정적으로 유전자주입한 A549 IL-8 NF-${\kappa}B$ luciferase 세포주를 제조해 사용하였고 NF-${\kappa}B$ DNA 결합은 electromobility shift assay(EMSA)를 이용하였다. p65 전사활성을 assay하기 위해서는 Gal4-p65 fusion protein expression system을 유전자주입과 luciferase assay를 통하여 시행하였다. Transcriptional coactivator의 역할을 규명 하가 위하여서는 CBP(CREB-binding protein)와 SRC-1(steroid receptor coactivator-1) 발현 벡터를 유전자 주입하고 luciferase assay를 이용하여 확인하였다. 결과 : Luciferase assay로 triptolide가 PMA와 IL-$1{\beta}$자극에 의한 IL-8 NF-${\kappa}B$ 활성을 의미있게 감소시킴을 확인하였다. IL-8 ELISA와 RT-PCR로 triptolide가 PMA와 IL-$1{\beta}$ 자극에 의해 유도되는 IL-8 발현을 각각 단백질과 mRNA 수준에서 억제함을 관찰하였다. Triptolide가 PMA와 IL-$1{\beta}$에 의한 IL-8 NF-${\kappa}B$의 전사활성을 억제시킨 반면 EMSA와 $I{\kappa}B{\alpha}$ Western blot을 이용한 실험에서는 triptolide가 NF-${\kappa}B$ DNA 결합과 $I{\kappa}B{\alpha}$의 분해에 전혀 영향을 미치지 못함을 확인하였다. 이러한 전사활성 억제와 DNA 결합 간의 불일치의 원인으로서는 DNA 결합 이후에 발생하는 핵내 에서의 transactivation에 triptolide가 영향을 미치리라고 생각되어 p65 transactivation study를 Gal4-p65T A(p65의 transactivation domain) fusion protein 발현 시스템과 luciferase assay를 이용하여 시행한 결과 triptolide가 p65 transactivation을 억제함으로써 NF-${\kappa}B$를 억제함을 확인하였다. 그러나 CBP나 SRC-1과 같은 coactivator의 역할을 규명하기 위한 유전자주입 실험에서 triptolide에 의한 p65 transactivation 억제에 대해 CBP나 SRC-1의 과발현이 별다른 영향을 미치지 못하였다. 결론 : Triptolide는 폐상피세포에서 NF-${\kappa}B$ 의존성 IL-8 유전자의 전사활성을 억제하고 그 기전은 $I{\kappa}B{\alpha}$ 경로가 아닌 핵내에서의 p65 transactivation 억제에 의해 발생하며 이에는 CBP나 SRC-1과 같은 coactivator가 관여하지 않음을 확인하였다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제48권5호
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• pp.682-698
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• 2000

Glucocorticoid receptor (GR) functions as a suppressor of inflammation by inhibiting the expression of many cytokine genes activated by NF-${\kappa}B$. The goal of this study is to investigate the mechanism by which GR repress NF-${\kappa}B$ activation in lung epithelial cells. We used A549 and BEAS-2B lung epithelia! cell lines. Using Ig$G{\kappa}$-NF-${\kappa}B$ luciferase reporter gene construct, we found that dexamethasone significantly suppressed TNF-$\alpha$-induced NF-${\kappa}B$ activation and the overexpression of GR showed dose-dependent reduction of TNF-$\alpha$-induced NF-${\kappa}B$ activity in both cell lines. However, DNA binding of NF-${\kappa}B$ induced by TNF-$\alpha$ in electromobility shift assay was not inhibited by dexamethasone. Super shift assay with anti-p65 antibody demonstrated the existence of p65 in NF-${\kappa}B$ complex induced by $\alpha$ Western blot showed that $I{\kappa}B{\alpha}$ degradation induced by TNF-$\alpha$ was not affected by dexamethasone and $I{\kappa}B{\kappa}$ was not induced by dexamethasone, neither. To evaluate p65 specific transactivation, we adopted co-transfection study of Gal4-p65TA1 or TA2 fusion protein expression system together with 5xGal4-luciferase vector. Co-transfection of GR with Gal4-p65TA1 or TA2 repressed luciferase activity profoundly to the level of 10-20% of p65TA1- or TA2-induced transcriptional activity. And this transrepressional effect was abolished by co-transfection of CBP of SRC-1 expression vectors. These results suggest that GR-mediated transrepression of NF-${\kappa}B$ in lung epithelial cells is through competing for binding to limiting amounts of transcriptional coactivators, CBP or SRC-1.