• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제30권7호
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• pp.938-943
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• 2017

Objective: Qingyu pig, a Chinese indigenous pig breed, exhibits two types of coat colour phenotypes, including pure black and white with black spotting respectively. Melanocortin receptor 1 (MC1R) and agouti signaling protein (ASIP) are two widely reported pivotal genes that significantly affect the regulation of coat colour. The objectives of this study were to investigate whether the polymorphisms of these two genes are associated with coat colour and analyze the molecular mechanism of the coat colour separation in Qingyu pig. Methods: We studied the phenotype segregation and used polymerase chain reaction amplification and Sanger sequencing to investigate the polymorphism of MC1R and ASIP in 121 Qingyu pigs, consisting of 115 black and 6 white with black spotted pigs. Results: Coat colour of Qingyu pig is associated with the polymorphisms of MC1R but not ASIP. We only found 2 haplotypes, $E^{QY}$ and $E^{qy}$, based on the 13 observed mutations from MC1R gene. Among which, $E^{qy}$ presented a recessive inheritance mode in black spotted Qingyu pigs. Further analysis revealed a g.462-463CC insertion that caused a frameshift mutation and a premature stop codon, thus changed the first transmembrane domain completely and lost the remaining six transmembrane domains. Altogether, our results strongly support that the variety of Qingyu pig's coat colour is related to MC1R. Conclusion: Our findings indicated that black coat colour in Qingyu pig was dominant to white with black spotted phenotype and MC1R gene polymorphism was associated with coat colour separation in Qingyu pig.

• Archives of Pharmacal Research
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• 제26권10호
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• pp.846-854
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• 2003

The oligomerization of G-proteincoupled receptors (GPCRs) has been shown to occur by various mechanisms, such as via disulfide covalent linkages, non covalent (ionic, hydrophobic) interactions of the N-terminal, and/or transmembrane and/or intracellular domains. Interactions between GPCRs could involve an association between identical proteins (homomers) or non-identical proteins (heteromers), or between two monomers (to form dimers) or multiple monomers (to form oligomers). It is believed that muscarinic receptors may also be arranged into dimeric or oigomeric complexes, but no systematic experimental evidence exists concerning the direct physical interaction between receptor proteins as its mechanism. We undertook this study to determine whether muscarinic receptors form homomers or a heteromers by direct protein-protein interaction within the same or within different subtypes using a yeast two-hybrid system. Intracellular loops (i1, i2 and i3) and the C-terminal cytoplasmic tails (C) of human muscarinic (Hm) receptor subtypes, Hm1, Hm2 and Hm3, were cloned into the vectors (pB42AD and pLexA) of a two-hybrid system and examined for heteromeric or homodimeric interactions between the cytoplasmic domains. No physical interaction was observed between the intracellular domains of any of the Hm/Hm receptor sets tested. The results of our study suggest that the Hm1, Hm2 and Hm3 receptors do not form dimers or oligomers by interacting directly through either the hydrophilic intracellular domains or the C-terminal tail domains. To further investigate extracellular domain interactions, the N-terminus (N) and extracellular loops (o1 and o2) were also cloned into the two-hybrid vectors. Interactions of Hm2N with Hm2N, Hm2o1, Hm2o2, Hm3N, Hm3o1 or Hm3o2 were examined. The N-terminal domain of Hm2 was found to have no direct interaction with any extracellular domain. From our results, we excluded the possibility of a direct interaction between the muscarinic receptor subtypes (Hm1, Hm2 and Hm3) as a mechanism for homo- or hetero-meric dimerization/oligomerization. On the other hand, it remains a possibility that interaction may occur indirectly or require proper conformation or subunit formation or hydrophobic region involvement.

• 생명과학회지
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• 제21권7호
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• pp.1032-1038
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• 2011

최근에 Ciona intestinalis에서 확인된 막 전위 감지 탈인산화 효소는 이온 채널과 유사한 막 통과 도메인과 유사 탈인산화 효소 도메인으로 이루어져 있다. 이 Ci-VSP는 그 막 통과 도메인에 의해 막 전위 변화를 감지하고 유사 탈인산화 효소에 의해 인산화된 이노시틸 인지질들에 대한 탈인산화 활성을 보이는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 6개의 히스티딘이 융합된 Ci-VSP의 유사 탈인산화 효소 도메인의 발현 시스템 구축을 추구하였다. 그래서 본 논문은 그 시스템의 구축과 발현 그리고 정제 조건 확립, 마지막으로 그 효소 동력학적인 활성을 pNPP에 대한 검토한 결과를 보고한다. 본 연구 결과에 따르면 Ci-VSP(248-576)-His 단백질 발현 및 정제시에 다른 단백질들의 정제 조건과 다르게 25 mM NaCl과 100 mM 정도의 이미다졸이 필요함을 확인하였다. 정제된 단백질을 가지고 탈인산화 효소의 대표적인 기질인 pNPP를 이용하여 그 동력학적인 상수 측정을 시도한 결과 정상 상태 동력학 측정 조건으로 온도 $37^{\circ}C$, pH 5.0 내지 5.5, 반응 시간 30분 이내, 반응 단백질 양 $2.0\;{\mu}g$ 이내가 적합하다는 점을 알게 되었다. 이러한 확립된 조건을 토대로 pNPP에 대한 동력학적 상수를 측정한 결과 $K_m$ 값은 $354{\pm}0.143\;{\mu}M$이며 $V_{max}$는 $0.0607{\pm}0.0137\;{\mu}mol$/min/mg이며 $k_{cat}$ 값은 $2.359{\pm}0.009751\;min^{-1}$인 것으로 확인되었다. 이를 통해 본 연구는 Ci-VSP(248-576)-His의 순도 높은 정제 결과와 pNPP에 대한 높은 활성 보임을 제시하였다. 이러한 연구 결과를 통해 향후 Ci-VSP에 대한 구조적인 연구 등을 포함하는 다양한 생화학적인 연구가 수행되리라 본다.

• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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• pp.59-59
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• 2003

ADAM은 metalloprotease/disintegrin domain을 가진 transmembrane glycoprotein으로서 지금까지 30종류 이상의 ADAM 및 10종류 이상의 ADAM-TS 단백질이 알려져 있다. 이들의 기능은 포유동물의 수정 시 sperm-egg binding과 fusion, myoblast fusion, integrin과의 결합 등에 직접 관여하거나, TNF-alpha 등의 생체신호전달물질이 세포로부터 분비될 때에 이들의 구조를 변화시켜 활성화시키는 효소로서의 작용, 그리고 dendritic cell differentiation 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 난소가 제거된 생쥐를 이용하여 자궁조직의 ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17 그리고 -TS1의 gene의 발현이 $17 \beta $-estradiol에 의하여 조절되는 지를 알아보았다. 생후 6 - 8주 된 암컷 생쥐의 난소를 제거하고, 2 주 후에 $17 \beta $-estradiol ($E_2$), progesterone ($P_4$) 혹은 이 둘 혼합액 ($E_2 + P_4$)을 sesame oil에 녹여 근육주사하였다. 2, 6, 12 시간 후 각각 자궁 조직을 얻고 유전자의 발현 양상을 알아보기 위하여 시료로부터 total RNA을 추출하여 역전사 중합효소반응 (RT-PCR)을 실시하였다. Densitometry를 이용, rpL7에 대한 ADAMS의 mRNA 발현 양을 상대적으로 분석하였다. 그 결과 ADAM-8과 -15는 6시간째에서, ADAM-10과 -TS1은 2시간째에서 sesame oil을 주사하거나 $P_4$만을 주사한 군보다 E$_2$를 주사한 군에서 mRNA의 양이 현저하게 증가하였고 ADAM-12는 2시간째에서 ADAM-17은 12시간째에서 sesame oil을 주사하거나 $P_$만을 주사한 군보다 E$_2$를 주사한 군에서 mRNA의 양이 현저하게 증가하였다. 이러한 결과로 미루어 ADAM-8, -10, -15 그리고 TS1은 progesterone에 의하여, ADAM-12와 17은 $17 \beta $-estradiol에 의하여 유전자의 발현이 upregulation 되는 것으로 생각되어진다.

• 한국미생물생명공학회:학술대회논문집
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• 한국미생물생명공학회 2004년도 Annual Meeting BioExibition International Symposium
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• pp.278-281
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• 2004

The $\alpha$1,6-mannosyltransferase encoded by Saccharomyces cerevisiae OCH1 plays a key role for the outer chain initiation of the N-linked oligosaccharides. A search for Hansenula polymorpha genes homologous to S. cerevisiae OCHI (ScOCH1) has revealed seven open reading frames (ORF100, ORF142, ORF168, ORF288, ORF379, ORF576, ORF580). All of the seven ORFs are predicted to be a type II integral membrane protein containing a transmembrane domain near the amino-terminal region and has a DXD motif, which has been found in the active site of many glycosyltransferases. Among this seven-membered OCH1 gene family of H. polymorpha, we have carried out a functional analysis of H. polymorpha ORF168 (HpOCH2) showing the highest identity to ScOCH1. Inactivation of this protein by disruption of corresponding gene resulted in several phenotypes suggestive of cell wall defects, including hypersensitivity to hygromycin B and sodium deoxycholate. The structural analysis of N-glycans synthesized in HpOCH2-disrupted strain (Hpoch2Δ) and the in vitro $\alpha$1,6-mannosyltransferase activity assay strongly indicate that HpOch2p is a key enzyme adding the first $\alpha$1,6-mannose residue on the core glycan Man$_{8}$GlcNAc$_2$. The Hpoch2Δ was further genetically engineered to synthesize a recombinant glycoprotein with the human compatible N-linked oligosaccharide, Man$_{5}$GlcNAc$_2$, by overexpression of the Aspergillus saitoi $\alpha$1,2-mannosidase with the 'HDEL” ER retention signal.gnal.

• 미생물학회지
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• 제47권1호
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• pp.7-13
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• 2011

일반적으로 대장균을 숙주로 이용하여 고등생물 유래 막단백질을 발현시킬 경우 발현된 막단백질은 숙주 세포에 치명적인 독성을 보인다. 우리가 발현을 시도한 15개의 인간 막단백질 중에서 특히 퓨린수용체 $P2X_4$ 발현은 대장균에 강한 독성을 보였다. 이러한 독성의 원인을 알아보기 위해 hydroxylamine을 사용하여 하여 인간 $P2X_4$ 유전자를 돌연변이 시키고 독성이 약해진 돌연변이체를 선별하였다. 돌연변이체 단백질을 면역블랏으로 분석한 결과 야생형에 비해 모두 단백질의 크기가 작았다. 크기가 제법 큰 돌연변이 두 개를 골라 DNA 서열분석을 해보니 130번째, 또는 194번째 Trp 코돈이 종결코돈으로 바뀜으로써 두 번째 막통과 도메인이 사라진 truncated protein이라는 사실을 알았다. 이들 돌연변이체의 세포내 위치를 추적해보니 둘 다 세포막에 삽입되어 있지는 않았다. 이런 결과를 종합해 볼 때 $P2X_4$의 발현이 대장균에 독성을 보이기 위해서는 전체 단백질의 올바른 세포막 삽입이 중요함을 시사한다.

• BMB Reports
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• 제51권5호
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• pp.236-241
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• 2018

Anoctamin 1 (ANO1) is an anion channel that is activated by changes in cytosolic $Ca^{2+}$ concentration and noxious heat. Although the critical roles of ANO1 have been elucidated in various cell types, the control of its gating mechanisms by $Ca^{2+}$ and heat remain more elusive. To investigate critical amino acid residues for modulation of $Ca^{2+}$ and heat sensing, we constructed a randomized mutant library for ANO1. Among 695 random mutants, reduced $Ca^{2+}$ sensitivity was observed in two mutants (mutant 84 and 87). Consequently, the E143A mutant showed reduced sensitivity to $Ca^{2+}$ but not to high temperatures, whereas the E705V mutant exhibited reduced sensitivity to both $Ca^{2+}$ and noxious heat. These results suggest that the glutamic acids (E) at 143 and 705 residues in ANO1 are critical for modulation of $Ca^{2+}$ and/or heat responses. Furthermore, these findings help to provide a better understanding of the $Ca^{2+}$-mediated activation and heat-sensing mechanism of ANO1.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.107-107
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• 2002

ADAM은 metalloprotease/disintegrin domain을 가진 transmembrane glycoprotein 으로서 지금까지 30개 이상의 ADAM 및 10개 이상의 ADAMTS 단백질이 알려져 있다. 이들의 기능은 포유동물의 수정시 sperm-egg binding과 fusion, myoblast fusion, integrin과의 결합 등에 직접 관여하거나, TNF-alpha 등의 생체 신호전달물질이 세포로부터 분비될 때에 이들의 구조를 변화시켜 활성화시키는 효소작용, 그리고 dendritic cell differentiation 등에 관여하는 것으로 알려져있다. 그러나 자궁내막 조직에서의 유전자 및 단백질 발현 여부에 관해서는 거의 보고되어 있지 않고 있다. 먼저 RT-PCR 방법을 이용하여 자궁에서 mRNA의 양을 $\beta$-actin의 양에 대하여 상대적으로 측정한 결과, 임신 1일부터 5일까지는 ADAM-9, 10, 17, TS1의 mRNA 경우 거의 비슷하게 발현되었으며 ADAM-8과 15는 3일째, ADAM-12는 2일째와 4일째에 현저하게 증가하였다 임신 6일부터 8일까지의 자궁조직을 각각 embryo가 착상된 곳과 그렇지 않은 곳으로 나누어 조사한 결과 상대적으로 착상이 된 곳에서 mRNA가 많이 발현 되었으며 특히 ADAM-8, 12, 15의 mRNA의 경우 현저한 차이를 보였다. Immunoblotting 방법을 이용하여 임신 1일부터 5일까지의 단백질의 발현 양상을 조사한 결과 임신 ADAM-8은 3일 이후 감소되는 양상을 보였으며 ADAM-9, 15, TS1은 5일째에 증가하는 양상을 보였다. ADAM-10은 2일째 감소하다가 다시 증가하고 ADAM-12, 17은 3, 4일째 증가하다가 5일째 감소하는 상을 보였다. 한편 임신 6일부터 8일까지는 embryo가 착상된 곳이 그렇지 않은 곳보다 조사된 모든 ADAMs 단백질이 상대적으로 많이 발현되는 양상을 보였다. 이러한 결과로 미루어 ADAMs은 임신 초기 착상과정과 임신 단계에 따른 자궁의 조직 재구성에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

• 대한의생명과학회지
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• 제11권2호
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• pp.135-141
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• 2005

A Jopock (Jpk), a trans-acting factor associating with the position-specific regulatory element of murine Hoxa-7, has shown to have a toxicity to both prokaryotic and eukaryotic cells when overexpressed. Since Jpk protein harbors a transmembrane domain and a putative endoplasmic reticulum (ER)-retention signal at the N-terminus, a subcellular localization of the protein was analyzed after fusing it into the green fluorescent protein (GFP): Both N-term (Jpk-EGFP) and C-term tagged-Jpk (EGFP-Jpk) showed to be localized in the ER when analyzed under the fluorescence microscopy after staining the cells with ER- and MitoTracker. Since ER stress triggers the ER-stress mediated apoptosis to eliminate the damaged cells, we analyzed the expression pattern of Jpk under ER-stress condition. When MCF7 cells were treated with the ER-stress inducer such as DTT and EGTA, the expression of Jpk was upregulated at the transcriptional level like that of Grp78, a molecular chaperone well known to be overexpressed under ER-stress condition. In the presence of high concentration of ER-sterss inducer (10 mM), about 70 (DTT) to $95\%$ (EGTA) of cells died stronly expressing ($10\~12$ fold) Jpk. Whereas at the low concentration ($0.001\~1.0\;mM$) of the inducer, the expression of Jpk was increased about 2.5 (EGTA) to 5 fold (DTT), which is rather similar to those of ER chaperone protein Grp78. These results altogether indicate that the ER-stress upregulated the expression of Jpk and the excess stress induces the ER-stress induced apoptosis and the concomitant expression of Jpk.

• 생물정신의학
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• 제8권2호
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• pp.239-245
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• 2001

Objective : Dopamine transporter is member of family of Na/Cl dependent neurotransmitter transporter, 12 transmembrane domain, that has high substrate specificity, affinity. It is related with dopamine reuptake in presynaptic vesicle. DAT has a VNTR in its 3'-untranslated region(UTR). 3'-UTR VNTR polymorphism is related with modification of dopamine transmission. The association between with VNTR polymorphism and neuropsychiatric disorders such as alcohol dependence, and low activity ALDH has been studied, but their relationship is unclear. We study about association of 3'-UTR VNTR of DAT gene and G2319A and alcohol dependence. Method : Group of Korean subjects were studied with alcohol dependence(n=49 male) compared to mentally healthy controls(n=53 male). The peripheral blood sample was acquired, and Polymerase Chain Reaction(PCR) amplification, MspI procedure was done. Result : There was a significant difference between alcohol dependence group and normal control(genotype frequency p<0.05, allele frequency p<0.05) Allele A frequency and genotype(GG, GA) frequency was a significant difference between alcohol dependence group and normal control(p<0.05). Conclusion : Our study showed that genetic polymorphism of DAT1 G2319A had relation with alcohol dependence.