• Journal of Veterinary Science
• /
• 제22권6호
• /
• pp.87.1-87.12
• /
• 2021

Background: African swine fever virus (ASFV), classical swine fever virus (CSFV), and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) are still prevalent in many regions of China. Co-infections make it difficult to distinguish their clinical symptoms and pathological changes. Therefore, a rapid and specific method is needed for the differential detection of these pathogens. Objectives: The aim of this study was to develop a multiplex real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (multiplex qRT-PCR) for the simultaneous differential detection of ASFV, CSFV, and PRRSV. Methods: Three pairs of primers and TaqMan probes targeting the ASFV p72 gene, CSFV 5' untranslated region, and PRRSV ORF7 gene were designed. After optimizing the reaction conditions, including the annealing temperature, primer concentration, and probe concentration, multiplex qRT-PCR for simultaneous and differential detection of ASFV, CSFV, and PRRSV was developed. Subsequently, 1,143 clinical samples were detected to verify the practicality of the assay. Results: The multiplex qRT-PCR assay could specifically and simultaneously detect the ASFV, CSFV, and PRRSV with a detection limit of 1.78 × 10⁰ copies for the ASFV, CSFV, and PRRSV, but could not amplify the other major porcine viruses, such as pseudorabies virus, porcine circovirus type 1 (PCV1), PCV2, PCV3, foot-and-mouth disease virus, porcine parvovirus, atypical porcine pestivirus, and Senecavirus A. The assay had good repeatability with coefficients of variation of intra- and inter-assay of less than 1.2%. Finally, the assay was used to detect 1,143 clinical samples to evaluate its practicality in the field. The positive rates of ASFV, CSFV, and PRRSV were 25.63%, 9.36%, and 17.50%, respectively. The co-infection rates of ASFV+CSFV, ASFV+PRRSV, CSFV+PRRSV, and ASFV+CSFV+PRRSV were 2.45%, 2.36%, 1.57%, and 0.17%, respectively. Conclusions: The multiplex qRT-PCR developed in this study could provide a rapid, sensitive, specific diagnostic tool for the simultaneous and differential detection of ASFV, CSFV, and PRRSV.

• Journal of Plant Biotechnology
• /
• 제40권1호
• /
• pp.18-26
• /
• 2013

살충성 유전자 mcry1Ac1을 포함하고 있는 해충저항성 유전자변형(GM) 벼 Agb0101이 국내에서 개발되었다. 향후 Agb0101 벼의 환경방출에 따른 모니터링과 이력추적을 위해서는 신뢰성 있는 검출방법의 개발이 필요하다. 따라서, 본 연구에서 해충저항성 GM벼의 사후 안전관리를 위한 정성적 및 정량적 PCR 검정 방법을 개발하였다. 벼 녹말분지효소 유전자 RBE4를 PCR 분석의 내재유전자로 사용하였고, 이의 primer쌍 RBEgh-1/-2는 101bp의 PCR 증폭산물을 형성하였다. 정성 PCR 분석을 위해서 삽입된 T-DNA를 바탕으로 특이 primer를 제작하였고, 이벤트 특이적 검출 primer의 경우 Agb0101의 도입유전자 및 벼 염색체 DNA 사이의 5' 또는 3' 인접염기부위를 정확하게 특이적으로 PCR 증폭하였다. 반면, 대조구인 각종 작물, 국내 벼 품종 및 Agb0101과 동일 형질전환 벡터를 갖는 해충저항성 벼에서는 어떠한 PCR 증폭산물도 형성하지 않았다. 표준물질로써 내재유전자 및 이벤트 특이적 단편으로 제조된 pRBECrR을 이용한 real-time PCR 분석에 의해서 정량한계(LOQ)가 10 copies 농도의 범위인 것으로 확인되었고, 이의 유효성을 검증하기 위하여 상이한 농도의 Agb0101시료(10, 5, 3 및 1%)를 real-time PCR 분석하여 정량검정에 대한 표준편차 및 상대표준편차가 각각 0.06 ~ 0.40 및 3.80 ~ 7.01%의 낮은 범위에 포함되는 것을 확인할 수 있었다. 이들 결과로 본 연구에서 개발된 정성 및 정량 PCR 검정 방법이 해충저항성 GM벼 Agb0101의 모니터링 및 이력추적에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 본다.