Intra and interspecfic fusants were produced by the protoplast fusion of auxotrophic mutants from Trichoderma koningii ATCC 26113 and Trichoderma reesei QM 9414. It was found that 0.6M $MgSO_4\;and\;0.6M\;NH_4Cl$ was the best osmotic stabilizer for the preparation of protoplasts from the mycelium of T. koningii and T. reesei respectively. However, $MgSO_4$ was the most suitable one for the regeneration of the protoplasts from both species. The intraspecific protoplast fusion frequencies between the auxotrophic mutants from T. reesei were $1.8{\times}10^{-2}\;to\;5.1{\times}10^{-1}$. Interspecific protoplast fusion frequencies between the auxotrophic mutants from T. koningii and T. reesei were $3.6{\times}10^{-3}$\;to\;8.4{\times}10^{-2}. Interspecific complementing fusants, however, were not alwats produced. Fusants obtained from interspecific potoplast fusion were spontaneously segregated into various strains including parental types, non-parental auxotrophic hybrids, and prototrophic hybrids on complete plate. Interspecific hybrids revealed to have partially enhanced celluloytic activities.
To examine the control effect of damping-off on radish caused by Pythium spp., researchers used the isolates of a fungivorous nematode, Aphelenchus avenae, and antagonistic fungi, Trichoderma spp. These were used as biocontrol agents, either alone, or in combination. Growth rates of the A. avenae isolates and fungal damages by the nematodes varied depending on Trichoderma spp., which contained lower T. koningii and T. virens cultures than other Trichoderma cultures. Phythium spp. were damaged by all five Aphelenchus isolates, but the multiplication rate of nematode isolate Aa-3 was very poor. Antibiotic activity of T. virens and T. harzianum to Pythium spp. was stronger than that of T. koningii. Control efficacy against damping-off of radish was most enhanced under the treatment using the nematode-T. harzianum combination. On the contrary, the combinations of the nematodes and T. virens or T. koningii mostly did not increase or decreased their control effect vis-$\`{a}$-vis that of the nematodes or antagonistic fungi being used alone. The results suggest that the fungivorous nematodes may play a leading role in the disease control, and that the activity of the fungivorous nematodes may be activated by T. harzianum, but inhibited by T. koningii and T.virens.
Ribonucleic acid interference (RNAi) inhibits the expression of target genes in a sequence-specific manner, and shows potential for gene knockdown in filamentous fungi, in which the locus-specific gene knockout occurs in low frequency. In this study, the function of the repressor of cellulase expression I (ACEI) was verified in Trichoderma koningii (T. koningii) YC01 through RNAi, and ace1-silenced strains with improved cellulase productivity were obtained. An expression cassette that transcribed the interfering double-stranded RNA (dsRNA) of ace1 was constructed and transformed into T. koningii, and the transformants, in which the expression of ace1 was successfully silenced, were selected. As a result of the ace1 gene silencing, the expression levels of the main cellulase and xylanase genes were elevated, and the enhanced production of total proteins, cellulase, and xylanase was observed in the cultivation. In addition, the down-regulation of ace1 resulted in an increasing expression of xyr1, but no clear variation in the expression of cre1, which suggested that ACEI acted as a repressor of the xyr1 transcription, but was not involved in the regulation of the cre1 expression. The results of this work indicate that ace1 is a valid target gene for enhancing enzyme production in T. koningii, and RNAi is an appropriate tool for improving the properties of industrial fungi.
We investigated the effect of Triton X-100 on the growth and morphology of Trichoderma koningii by comparing various parameters representing the frowth of mold in the presence or absence of Triton X-100. The specific growth rate and doubling time of T. koningii were not affected by the addition of 0.05% Triton X-100 in batch culture. However, in the presence of Triton X-100, cultures reached its stationary phase earlier and showed reduced level in total yield of biomass. The addition of Triton X-100 into solid medium also resulted in decrease in the colony radial growth rate and this response was correlated with the formation of mycelia which showed increase in branching and septation in the presence of Triton X-100.
Trichocderma koningii의 영양요구성 돌연변이주인 CUT 121로부터 얻은 원형질체를 야생형인 ATCC 26113의 핵과 혼합하여 PEG 용액을 처리한 결과, 독립 영양형의 형질전환체가 30 이상의 빈도로 생성되었다. 이 독립영양형 군체로부터 얻은 분리체 중의 하나는 xylanase의 활성이 야생형보다 3배 가량 증진되었으며, 다른 세포의 다당류 분해효소는 야생형과 유사한 수준을 나타내었다. 분리체의 DNA 함량, 인위적인 불리양상 및 동위효소 양상 등을 조사 분석한 결과, 독립영양형의 형질전환체는 실험에 사용된 형질전환체로 판명되었다. 이상의 결과로 Trichoderma속 균류의 균주개량법으로, 핵전이법이 통상의 원형질체 융합법보다 효율적인 것으로 판명되었다.
In this study, seven Trichoderma species (33 strains) were classified using secondary metabolite profile-based chemotaxonomy. Secondary metabolites were analyzed by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS-MS) and multivariate statistical methods. T. longibrachiatum and T. virens were independently clustered based on both internal transcribed spacer (ITS) sequence and secondary metabolite analyses. T. harzianum formed three subclusters in the ITS-based phylogenetic tree and two subclusters in the metabolitebased dendrogram. In contrast, T. koningii and T. atroviride strains were mixed in one cluster in the phylogenetic tree, whereas T. koningii was grouped in a different subcluster from T. atroviride and T. hamatum in the chemotaxonomic tree. Partial least-squares discriminant analysis (PLS-DA) was applied to determine which metabolites were responsible for the clustering patterns observed for the different Trichoderma strains. The metabolites were hetelidic acid, sorbicillinol, trichodermanone C, giocladic acid, bisorbicillinol, and three unidentified compounds in the comparison of T. virens and T. longibrachiatum; harzianic acid, demethylharzianic acid, homoharzianic acid, and three unidentified compounds in T. harzianum I and II; and koninginin B, E, and D, and six unidentified compounds in T. koningii and T. atroviride. The results of this study demonstrate that secondary metabolite profiling-based chemotaxonomy has distinct advantages relative to ITS-based classification, since it identified new Trichoderma clusters that were not found using the latter approach.
The conditions for the protoplast fusion of auxotrophic mutants of Trichoderma koningii were determined. A preparation of commercial enzyme Driselase was used successfully to isolate protoplasts from the 18 hr old mycelium of T. koningii. The yields of protoplasts production were ranged from $0.3{\times}10^8$ to $2.5{\times}10^8$ protoplasts per mg of damp mycelium of various auxotrophic mutant strains. The regeneration frequencies from $9.3{\times}10^{-3}\;to\;2.0{\times}10^{-1}$ were obtained when the protoplasts from auxotrophic mutants were plated on the malt extract medium containing 0.6M $MgSO_4$, and 2% agar, and the optimal concentration of PEG for protoplst fusion was 30%. Exposure of protoplasts to PEG for 10 min was found to be sufficient to induce high frequency heterokaryon formation. Optimal pH of fusion mixture was determined as 5.5, and 1 mM of calcium chloride in fusion mixture was found to be sufficient to enhance protoplast fusion frequency. Under optimal condition, the fusion frequency of the cross between protoplasts from various auxotrophic mutants were $1.6{\times}10^{-2}\;and\;4.1{\times}10^{-2}$.
한국 토괴균의 계속적인 연구로서, 분리된 균류중 Aspergillus 8종과 microfungi 5종인 Alternaria alternata, Chrysosporium pannorum, Doratomyces microsporus, Trichoderma koningii, T. viride에 관하여 보고하였다. 이들 동정된 균류 중 아직까지 한국에서 미기록된 것으로는 Chrysosporium pannorum, Doratomyces microsporus, Trichoderma koningii, T. viride 등의 4종이었다. 또한 완전연대인 Emericella nidulans var. nidulans에 관하여 보고하였다.
버섯 재배상(栽培床에)서 Trichoderma속(屬)을 분리, 동정하고 아울러 Trichoderma속(屬)이 생산하는 항생물질(抗生物質)이 느타리버섯균의 생육에 미치는 영향을 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) 분리된 Trichoderma속(屬)은 Rifai의 검색표에 따라 동정한 결과 Trichoderma hamatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii로 확인되었다. 2) 분리 동정된 Trichoderma속(屬) 중에서 Trichoderma viride(No. 10)이 느타리 버섯균 생육(生育)에 대한 저해율이 제일 높았다. 3) 각종 버섯균 중에서 Trichoderma viride(No. 10)에 의한 저해는 Pleurotus ostreatus와 Pleurotus sajor-caju가 제일 심했고 그 다음으로는 Lentinus edodes, Flammulina velutipes, Auricularicula auricula순이었다. 4) 추출된 백색 침상 결정 항균력(抗菌力)은 각각 1/10의 농도와 500ppm의 농도에서 cycloheximide $100{\sim}200ppm$의 항균력(抗菌力)에 해당하였다.
균상느타리버섯에서 발생하는 곰팡이 병해 중에서 가장 많은 문제를 발생하는 것은 Trichoderma disease 또는 green mould 등으로 불리우는 푸른곰팡이병이다. 이 병은 Trichoderma, Penicillium, Aspergillus 등의 속(genus)에 포함되는 종들에 의해 발병되는 병을 총칭하는 것으로 발생빈도와 피해가 가장 큰 것은 Trichoderma 속의 병원균에 의해 발생하였다. 느타리버섯 균상에 분리된 병원균은 T. longibrachiatum, T. koningii, Trichoderma virens, T atroviride, T. hazianum, T. pseudokoningii 6종이었으며, 발생빈도가 높은 것은 T. virens, T. hazianum, T. longibrachiatum 3종이었고, 각각의 균은 배양적 특성 및 병원성도 각기 다른 특성을 보이고 있었다. T. longibrachiatum 균사생장이 매우 빠르고, 포자형성이 빠르며, 특히 후막포자형성이 잘되는 특성을 있으며, 후기에는 진한 녹색으로 변색된다. Trichoderma koningii는 균사생장은 빠르고, 공중균사가 많은 편이며, 포자는 공중균사에 밀집되어 형성된다. 특히 Trichoderma virens 같은 경우에는 포자형성에 의한 색깔변화가 느리며, 감염후기에 발견되어 그 피해가 심한 편이었다. Trichoderma atroviride. 균사생장은 보통이며, 포자형성은 공중균사에 드물게 형성되며, 후기에는 진녹색을 띤다. 이균의 특징은 coconut 냄새와 유사한 향기가 나는 것이다. T. hazianum은 초기에는 균사가 백색으로 매우 빠르고, 공중균사에 포자가 형성하며, 후기에는 진한 녹색으로 변색된다. 공중 균사에 형성된 포자는 육안적으로 pustules or tufts의 형태를 나타내었다. Trichoderma pseudokoningii 균사생장은 빠르며, 포자형성은 접종부위를 중심으로 형성되며, 후기에는 환무니를 형성하며, 특히 배지 색이 변색되고 후막포자 잘 형성되는 특징이 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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