• Journal of Animal Science and Technology
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• 제64권5호
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• pp.937-949
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• 2022

Health concern of dogs is the most important issue for pet owners. People who have companied the dogs long-term provide the utmost cares for their well-being and healthy life. Recently, it was revealed that the population and types of gut microbiota affect the metabolism and immunity of the host. However, there is little information on the gut microbiome of dogs. Hericium erinaceus (H. erinaceus; HE) is one of the well-known medicinal mushrooms and has multiple bioactive components including polyphenol, β-glucan, polysaccharides, ergothioneine, hericerin, erinacines, etc. Here we tested a pet food that contained H. erinaceus for improvement in the gut microbiota environment of aged dogs. A total of 18 dogs, each 11 years old, were utilized. For sixteen weeks, the dogs were fed with 0.4 g of H. erinaceus (HE-L), or 0.8 g (HE-H), or without H. erinaceus (CON) per body weight (kg) with daily diets (n = 6 per group). Taxonomic analysis was performed using metagenomics to investigate the difference in the gut microbiome. Resulting from principal coordinates analysis (PCoA) to confirm the distance difference between the groups, there was a significant difference between HE-H and CON due to weighted Unique fraction metric (Unifrac) distance (p = 0.047), but HE-L did not have a statistical difference compared to that of CON. Additionally, the result of Linear discriminate analysis of effect size (LEfSe) showed that phylum Bacteroidetes in HE-H and its order Bacteroidales increased, compared to that of CON, Additionally, phylum Firmicutes in HE-H, and its genera (Streptococcus, Tyzzerella) were reduced. Furthermore, at the family level, Campylobacteraceae and its genus Campylobacter in HE-H was decreased compared to that of CON. Summarily, our data demonstrated that the intake of H. erinaceus can regulate the gut microbial community in aged dogs, and an adequate supply of HE on pet diets would possibly improve immunity and anti-obesity on gut-microbiota in dogs.

• Journal of Veterinary Science
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• 제23권6호
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• pp.12.01-12.10
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• 2022

Background: Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae are the main cause of clinical mastitis in dairy cattle in Argentina, whereas coagulase-negative staphylococci (CNS) and environmental streptococci are the main cause of subclinical mastitis. Bacteria isolated from infected animals show increasing antimicrobial resistance. Objectives: This study aims to determine the antimicrobial resistance of staphylococci and streptococci isolated from milk with mastitis, and to genotypically characterize the methicillin-resistant (MR) staphylococci. Methods: Isolation was performed on blood agar and identification was based on biochemical reactions. Antimicrobial susceptibility was according to the Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines. The antimicrobial resistance genes, SCCmec type and spa type were detected by the polymerase chain reaction method. Results: We isolated a total of 185 staphylococci and 28 streptococci from 148 milk samples. Among the staphylococcal isolates, 154 were identified as CNS and 31 as S. aureus. Among the 154 CNS, 24.6% (n = 38) were resistant to penicillin, 14.9% (n = 23) to erythromycin, 17.5% (n = 27) to clindamycin, 6.5% (n = 10) to cefoxitin and oxacillin. Among the S. aureus isolates, 16.1% (n = 5) were resistant to penicillin, 3.2% (n = 1) to cefoxitin and oxacillin (MRSA). Six MR isolates (5 CNS and 1 MRSA) were positive to the mecA gene, and presented the SCCmec IVa. The MRSA strain presented the sequence type 83 and the spa type 002. Among the 28 streptococcal isolates, 14.3% (n = 4) were resistant to penicillin, 10.7% (n = 3) to erythromycin and 14.3% (n = 4) to clindamycin. Conclusions: The present findings of this study indicate a development of antimicrobial resistance in main bacteria isolated from cows with mastitis in Argentina.

• Journal of Dairy Science and Biotechnology
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• 제41권2호
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• pp.76-85
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• 2023

본 연구는 유산균과 병원성균의 성장에 미치는 영향과 요구르트 제조에 적용 가능성을 검토하였다. 유산균인 W. cibaria KCCM 41287, W. paramesenteroides KCCM 40114, L. plantarum KCCM 11322, Lactobacillus lactis KCCM 43471, L. acidophilus KCCM 32820, L. cremoris KCCM 40699, L. bulgaricus KCCM 34717, S. thermophilus KCCM 40430은 석류 농축액에 의해서 성장이 촉진되었다. 석류 농축액의 농도가 증가함에 따라 현저한 성장 효과를 나타내었다. 반면 병원성균인 E. coli KCCM 11587, E. coli KCCM 11591, E. coli KCCM 11596, 그리고 E. coli KCCM 11600는 석류 농축액에 의해서 성장이 억제되었다. 석류 농축액의 농도가 증가함에 따라 성장은 현저하게 감소되었다. 병원성균에 대한 석류 농축물의 억제는 유산균에 대한 석류 농축물의 촉진 효과와는 반대의 결과를 보여주었다. 따라서 석류 농축액은 유산균에 있어서 프리바이오틱스로서 이용 가능성을 확인하였다. 한편, 석류 농축액을 첨가한 요구르트는 무첨가구에 비해 최적의 조건을 보였다. 특히 석류 농축액을 첨가한 요구르트에서 유산균의 생균 수가 유의하게 높았다. 또한 저장 중 요구르트에서는 무첨가구보다 석류 농축액을 첨가하여 제조한 요구르트에서 유산균의 생존율이 더 높았다. 따라서 석류 농축액은 프리바이오틱스로서의 가능성과 유제품의 적용 가능성이 확인되었다.

• 대한치과의료관리학회지
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• 제6권1호
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• pp.19-27
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• 2018

The purpose of this study was to determine the level of toothbrush bacterial growth, whether the dryness of the toothbrush head differs depending on the number of holes in the head, and to use these results as a reference for future toothbrush design. Two-millimeter holes were created on the head of the toothbrushes in groups of three, one, or zero holes. We made the solution with Streptococcus mutans, and the toothbrushes were placed in the solution and agitated. The toothbrushes were shaken to remove moisture and allowed to air-dry. The toothbrush heads were swabbed with saline and then placed in two inoculation groups. The first group was inoculated with a 102 dilution of the S. mutans culture and the second was inoculated with the original culture. After incubation, bacterial colony numbers were measured. The number of holes on the toothbrush head correlated with a decrease in number of cultured bacterial colonies. Our model of a toothbrush head with holes indicated that these holes in the toothbrush head were effective in reducing the level of microbial contamination and that a greater number of holes creates an improved toothbrush sanitation effect. The average number of colonies on the head of toothbrush by number of holes was high, followed by the number of holes 0, 1 and 3, and the average number of colony among toothbrush heads was same. The use of a toothbrush with holes between the toothbrush head indicates that it is effective in reducing the level of microbial contamination between the toothbrush head and toothbrush and the higher the number of holes, the better the effect.

• 한국자원식물학회지
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• 제36권4호
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• pp.264-274
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• 2023

본 연구는 제주지역에서 대량 발생하고 있는 생태계 교란 외래식물을 기능성 바이오소재로서의 이용 가능성을 확인하기 위한 연구의 일환으로서, 5종 외래식물체의 70% 에탄올 추출물을 대상으로 항산화, 항염증 및 항균 효과와 유효성분을 조사하였다. 외래식물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 애기수영 > 서양금혼초 ≥ 가시상추 > 환삼덩굴 ≥ 왕도깨비가지 순서로 나타났다. 외래식물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능 역시 애기수영에서 가장 높았으며, 항산화 효과는 식물 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 연관된 것으로 확인되었다. LPS로 자극시킨 RAW 264.7 세포에서 외래식물체 에탄올 추출물(100 ㎍ SE/mL)의 NO 및 PGE₂ 생성 억제 효과는 각각 약 20~60%와 10~70%로 나타났고, 애기수영 및 환삼덩굴이 다른 3종에 비해 우수한 것으로 나타났다. 4종의 식중독 유발 미생물 및 5종의 구강 미생물을 대상으로 식물 추출물의 항균 효과를 조사한 결과, 환삼덩굴, 애기수영 및 왕도깨비가지의 에탄올 추출물은 B. subtilis, E. coli, V. parahaemolyticus 및 V. vulnificus 4종 식중독균 모두에 대해 강한 항균 활성을 보였다. 구강충치 유발 미생물인 E. faecalis, L. casei, R. dentocariosa, S. epidermidis, S. mutans에 대한 항균 효과는 환삼덩굴 추출물이 효과적이었으며, 항균 활성에 관여하는 주 유효성분은 pentadecylic acid, palmitic acid, clionasterol 등인 것으로 예측되었다. 이상의 결과는 생태계 교란 외래식물, 특히 애기수영 및 환삼덩굴의 기능성을 갖는 유효성분 분리 및 이용화 연구에 중요한 기초자료가 될 것이며, 항산화, 항염증 및 항균제 개발을 위한 바이오소재 발굴 등에도 중요한 정보를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

• 산업식품공학
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• 제23권3호
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• pp.209-216
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• 2019

콩 가공 부산물인 콩 배아 이소플라본의 생체내 활성을 증가시키기 위하여 LA, LB, LP 등 3가지 유산균을 단독 또는 혼합하여 비배당체화 전환 효율을 증가시키고자 균주의 종류와 접종량, 발효시간에 따른 이소플라본 함량을 분석하였다. 그 결과 균주를 이용한 모든 발효에서 균주를 사용하지 않은 대조군에 비하여 높은 이소플라본 비배당체 전환을 보였고, 발효시간에 따른 비배당체 전환율은 24시간에서 급격히 증가하였고 이후에는 큰 변화는 보이지 않았다. 비배당체화 발효의 최적 균주는 LP균, 접종량은 5%, 발효시간은 24시간 이었다. 대조군의 이소플라본 배당체의 구성은 글리시틴>다이드진>제니스틴 순으로 가장 높은 함량을 나타내었고, 유산균을 접종하여 발효시켰을 때 배당체들은 감소하였고, 비배당체 함량이 증가하였으며, 다이드제인>글리시테인>제니스테인 순으로 45% 이상의 비배당체 전환율을 나타내었다. 특히, 대조군과 비교하여 유산균으로 발효시켰을 때 다이드진의 함량이 가장 크게 감소하였고, 다이드제인 함량이 가장 크게 증가하였다. 소야사포닌의 경우 발효에 의하여 Ab가 급격하게 감소하였고 Ba와 Bb가 증가하였다. 발효액은 pH 3에서 pH 6으로 증가함에 따라 이소플라본 비배당체 함량이 증가하였으며 특히, 다이드제인 함량이 많이 증가하였고, 소야사포닌 함량은 Ab 함량이 급격하게 감소하였고, Ba와 Bb 함량도 소량감소하는 등 발효액의 pH가 발효에 의한 이소플라본과 소야사포닌 함량 변화에 많은 영향을 미치는 중요한 요인중의 하나임을 알 수 있었고, LP균을 이용한 발효로 가공부산물인 콩 배아의 생리활성 증가 및 기능성소재화를 꾀할 수 있을 것으로 생각된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제33권9호
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• pp.1213-1227
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• 2023

Fetal growth restriction (FGR) is a prevalent obstetric condition. This study aimed to investigate the role of Toll-like receptor 9 (TLR9) in regulating the inflammatory response and gut microbiota structure in FGR. An FGR animal model was established in rats, and ODN1668 and hydroxychloroquine (HCQ) were administered. Changes in gut microbiota structure were assessed using 16S rRNA sequencing, and fecal microbiota transplantation (FMT) was conducted. HTR-8/Svneo cells were treated with ODN1668 and HCQ to evaluate cell growth. Histopathological analysis was performed, and relative factor levels were measured. The results showed that FGR rats exhibited elevated levels of TLR9 and myeloid differentiating primary response gene 88 (MyD88). In vitro experiments demonstrated that TLR9 inhibited trophoblast cell proliferation and invasion. TLR9 upregulated lipopolysaccharide (LPS), LPS-binding protein (LBP), interleukin (IL)-1β and tumor necrosis factor (TNF)-α while downregulating IL-10. TLR9 activated the TARF3-TBK1-IRF3 signaling pathway. In vivo experiments showed HCQ reduced inflammation in FGR rats, and the relative cytokine expression followed a similar trend to that observed in vitro. TLR9 stimulated neutrophil activation. HCQ in FGR rats resulted in changes in the abundance of Eubacterium_coprostanoligenes_group at the family level and the abundance of Eubacterium_coprostanoligenes_group and Bacteroides at the genus level. TLR9 and associated inflammatory factors were correlated with Bacteroides, Prevotella, Streptococcus, and Prevotellaceae_Ga6A1_group. FMT from FGR rats interfered with the therapeutic effects of HCQ. In conclusion, our findings suggest that TLR9 regulates the inflammatory response and gut microbiota structure in FGR, providing new insights into the pathogenesis of FGR and suggesting potential therapeutic interventions.

• Animal Bioscience
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• 제37권7호
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• pp.1213-1224
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• 2024

Objective: Enterotypes (ETs) are the clustering of gut microbial community structures, which could serve as indicators of growth performance and carcass traits. However, ETs have been sparsely investigated in waterfowl. The objective of this study was to identify the ileal ETs and explore the correlation of the ETs with growth performance and carcass traits in Muscovy ducks. Methods: A total of 200 Muscovy ducks were randomly selected from a population of 5,000 ducks at 70-day old, weighed and slaughtered. The growth performance and carcass traits, including body weight, dressed weight and evidenced weight, dressed percentage, percentage of apparent yield, breast muscle weight, leg muscle weight, percentage of leg muscle and percentage of breast muscle, were determined. The contents of ileum were collected for the isolation of DNA and 16S rRNA gene sequencing. The ETs were identified based on the 16S rRNA gene sequencing data and the correlation of the ETs with growth performance and carcass traits was performed by Spearman correlation analysis. Results: Three ETs (ET1, ET2, and ET3) were observed in the ileal microbiota of Muscovy ducks with significant differences in number of features and α-diversity among these ETs (p<0.05). Streptococcus, Candida Arthritis, and Bacteroidetes were the presentative genus in ET1 to ET3, respectively. Correlation analysis revealed that Lactococcus and Bradyrhizobium were significantly correlated with percentage of eviscerated yield and leg muscle weight (p<0.05) while ETs were found to have a close association with percentage of eviscerated yield, leg muscle weight, and percentage of leg muscle in Muscovy ducks. However, the growth performance of ducks with different ETs did not show significant difference (p>0.05). Lactococcus were found to be significantly correlated with leg muscle weight, dressed weight, and percentage of eviscerated yield. Conclusion: Our findings revealed a substantial variation in carcass traits associated with ETs in Muscovy ducks. It is implied that ETs might have the potential to serve as a valuable biomarker for assessing duck carcass traits. It would provide novel insights into the interaction of gut microbiota with growth performance and carcass traits of ducks.

• 한국수산과학회지
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• 제17권6호
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• pp.511-522
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• 1984

낙동강 하류 수계는 농수산업을 비롯하여 각 산업의 용수 뿐만아니라 400만 부산시민의 상수 급수원으로서도 대단히 중요하다. 본 수계의 효율적인 활용을 위하여 하구언을 축조하고 있다. 그래서 본 연구는 하구언 설치 이전과 이후의 수질 변화에 대한 기초재료를 얻기 위하여 1983년 8월부터 1984년 7월까지 계절마다 2회씩 모두 8회에 걸쳐 15개 지점에서 총 시료 120개를 취하여 분석하였다. 이들 시료에 대한 수온, pH, 염소 ion 및 염분도, 화학적 산소 요구량, 전기전도도, 영양염류, 위생지표세균, microflora에 대한 실험 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 수온의 연간변화는 $-1.5{\sim}29.0^{\circ}C$로 컸으며, 봄철의 수온은 $10{\sim}15^{\circ}C$로서 겨울철보다 약 $10^{\circ}C$ 상승하였고, 가을철의 수온은 전 지점에서 $20^{\circ}C$ 부근으로 매우 안정되었다. 여름철에는 기온의 상승에 따라 $21{\sim}29^{\circ}C$로 높았다. 2. pH의 연간변화는 $6.68{\sim}8.50$이었으며, 평상시의 pH는 상부수역에서 하구쪽으로 향할수록 점증하였으며, 하구수역에서는 8에 가까웠다. 그러나 강우량이 많았던 직후에는 오히려 상부수역이 높고 하구수역이 낮아지는 반대현상이었다. 3. 염소 ion 농도의 변화범위는 $7.4{\sim}l.020.5$ mg/l로 지점별 차가 심하였다. 또, 염분또는 $1.05{\sim}33.01\%$로 넓은 범위로 분포되었다. 상부에 녹산 수문이 있는 제3수로는 $25.76{\sim}31.58\%0$으로 육수나 하천수의 영향을 많이 받고 있는 제1, 2수로보다 높은염도를 나타내며 안정되어 있다. 4. 화학적 산소 요구량의 변화범위는 $1.45{\sim}14.94$ mg/l였으며, 상부, 중부수역과 각 수로의 기점은 5mg/l 이상이었고, 하구수역은 수산 2급 기준치인3 ppm을 모두 초과하였다. 5. 전기전도도의 변화범위는 $1.360{\times}10^2{\sim}5.650{\times}10^4{\mu}{\mho}/cm$였으며, 상부수역에서 보다 하구수역에서 월등히 높았으며 강우량이 많을시에는 전 수역에서 낮은 값으로 나타났다. 6. 영양염류의 년중 변화범위는 $NO_2-N\;:\;0.008{\sim}0.040$ mg/l, $NO_3-N\;:\;0.038{\sim}5.253$ mg/l, $NH_4-N\;:\;0.100{\sim}2.685$ mg/l, $PO_4-P\;:\;0.003{\sim}0.084$ mg/l, $SiO_2-Si\;:\;0.154{\sim}6.123$mg/l였으며, 각종 염류는 일반적으로 상부, 중부수역에서 높은 농도였으나, 강우량에 육수나 강수에 의해 운반되어 하구수역에서 농도가 높아진다. 특히 하구수역에서 질소, 인화합물이 20년전에 비하여 $2{\sim}3$배 증가되고 있어 이차적인 환역오염이 우려 된다. 7. 대장균군 최확수의 분포범위는 $7.3{\sim}460,000/100ml$였으며, 금곡에서 을숙도 구간인 중부수역에서의 기하평균치는 $3,476{\sim}34,700/100ml$으로 극심한 오염도를 나타내었다. 이 수질의 여파와 장림천 괴정천에서 유입되는 오수로 제1수로의 수질은 $1.100{\sim}460,000/100ml$로 제 2수로 보다 5배나 심하게 오염되어 있었다. 분편계대장균 최확수의 분포범위는 $3.6{\sim}460,000/100ml$였으며, 대장균군에서와 같은 양상이었다. 장구균 최확수는 $0{\sim}46,000/100ml$의 분포범위로 분편계대장균과 같은 양상이었다. 8. 대장균군으로 분리 동정된 총 452균주중에서 Escherchia coli group은 127 균주로 $28\%$, Citrobacter freundii group은 82 균주로 $18\%$, Enterobacter aerogenes group이 141균주, $31\%$로 제일 많았으며, 분류되지 않은것이 $22\%$ 정도였다. 9. 생균수의 연간 변화폭은 $<30{\sim}1.2{\times}10^5/ml$였으며, 각 수역별로 위생지표세균이 변화하였던 것과 같은 양상이었다. 10. 본 수계에서 분리 동정된 세균 총 659 균주중에서 Pseudomonas 속이 279 균주($42\%$)로서 제일 많았으며, Flavebacterium cytophaga 속이 131균주($20\%$), Moraxella속이 72균주($12\%$) 순이었으며, Bacillus 속이 $0.3\%$으로 제일 낮은 빈도를 나타내었다.

• 한국식품영양학회지
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• 제24권3호
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• pp.367-375
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• 2011

본 연구는 효모 Kuyveromyces fragilis와 유산균 Streptococcus thermophiles, Lactobacillus bulgaricus의 starter를 유청 분말(대조구: A, 2%: B, 4%: C, 6%: D, 8%: E)이 첨가된 탈지분유에 혼합 접종하여 한국형 Koumiss를 제조하였다. 이 제품의 지방, 단백질, 유당, 적정산도, pH, 생균수, 알코올 함량, 휘발성 지방산, 휘발성 유리아미노산 및 무기물을 측정하였다. 그 결과는 다음과 같았다. 유청 분말의 농도에 따라 지방 함량은 대조구 0.74%, B는 1.14%, C는 1.57%, D는 2.00%, E는 2.30%로 증가하였고, 단백질함량은 대조구 2.95%, B는 3.66%, C는 3.87%, D는 4.22%, E는 4.39%로 증가했으며, 유당 함량은 대조구 3.10%, B는 4.74%, C는 5.78%, D는 6.59%, E는 7.43%로 증가하였다. 농도에 따라 적정산도 및 pH도 점진적인 증가를 보였다. 유산균의 경우 유청 분말의 농도가 높을수록 증가하였는데, 대조구는 $2.4{\times}10^9\;cfu/m{\ell}$, B는 $2.7{\times}10^9\;cfu/m{\ell}$, C는 $3.1{\times}10^9\;cfu/m{\ell}$, D는 $3.4{\times}10^9\;cfu/m{\ell}$, E는 $3.8{\times}10^9\;cfu/m{\ell}$로 검출 되었고, 효모수는 유청 분말의 농도에 따라 대조구는 $6.1{\times}10^7\;cfu/m{\ell}$, B는 $8.6{\times}10^7\;cfu/m{\ell}$, C는 $1.08{\times}10^8\;cfu/m{\ell}$, D는 $1.27{\times}10^8\;cfu/m{\ell}$, E는 $1.65{\times}10^8\;cfu/m{\ell}$로 역시 증가하였다. 알코올 함량은 대조구의 평균이 0.863%, B의 평균은 0.963%, C의 평균은 0.890%, D의 평균은 1.290%, E의 평균은 1.313%로 유청 분말의 농도가 높을수록 알코올 함량도 점진적으로 증가하는 경향을 보여주었다. E에서 알코올 함량 평균 1.313%는 카자흐스탄 Koumiss의 알코올 함량 평균 1.08%보다 높게 나타났다. 유리아미노산은 모두 16종의 아미노산이 검출되었다. Glycine은 대조구에서 0.38 mg/$m{\ell}$로 E에서는 0.64 mg/$m{\ell}$로 유청 분말 농도에 따라 높아졌으며, histidine도 대조구가 0.42 mg/$m{\ell}$에서 E는 0.65 mg/$m{\ell}$로 높아졌다. 반면에 glutamic acid는 대조구가 4.13 mg/$m{\ell}$에서 E가 6.96 mg/$m{\ell}$로 함량이 높아졌으며, proline도 대조구가 1.71 mg/$m{\ell}$에서 E가 2.80 mg/$m{\ell}$로 높아졌다. Aspartic acid, leucine도 대조구보다 E가 더 많이 함유된 것으로 나타났다. 휘발성 유리지방산의 경우에서도 대조구와 B, C, D, E의 휘발성 유리지방산의 함량이 대체로 증가하는 경향을 보여주었고, 초산은 대조구의 함량이 $12,661{\mu}g/100 m{\ell}$이었고, E에서는 $37,140{\mu}g/100m{\ell}$로 증가하였다. 낙산은 대조구에서는 측정되지 않았고, E에서 $1,950{\mu}g/100m{\ell}$로 측정되었으며, 가프른산에서는 대조구가 $177{\mu}g/100m{\ell}$이었고, E에서는 $812{\mu}/100m{\ell}$로 함량이 증가하였다. 발레린산은 대조구에서 $22{\mu}g/100m{\ell}$로 미량 측정되었으나, 다른 시험구에서는 측정되지 않았다. 무기물 Ca, P, Mg, Na, K의 각각의 성분은 Ca의 경우 대조구가 1,042.38 ppm에서 E는 1,535.12 ppm으로, P의 경우 대조구가 863.61 ppm에서 E는 1,336.71 ppm으로, Mg의 경우 대조구가 101.28 ppm에서 E는 162.44 ppm으로, Na의 경우 대조구가 447.19 ppm에서 E는 1,001.57 ppm으로, K의 경우 대조구가 1,266.39 ppm에서 E는 2,613.93 ppm으로 유청 분말의 함량이 높을수록 무기물 또한 증가하는 것으로 나타났다. 관능검사는 유청 분말의 첨가가 많을수록 전반적으로 점수가 높음을 보여주었다. 풍미는 대조구가 6.3점으로 가장 낮았고, E는 8.2점으로 가장 높았다. 조직은 유청 분말을 첨가하지 않은 대조구가 4.2점으로 가장 높게 나타났고, 외관은 시험구들 사이에 별 차이를 보이지 않았다.