• Mycobiology
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• 제31권3호
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• pp.133-138
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• 2003

Analysis of phylogenetic relationship was performed among Phellinus species based on 18S ribosomal subunit sequence data. Twenty-five strains of 19 Phellinus species including P. linteus were examined in this study. Regions of 18S ribosomal subunit were very conserved, but some variable regions between Phellinus species were observed. The species-specific detection primers, modified by 2 or 3 nucleotides in sense primer were designed based on 18S ribosomal DNA(rDNA) sequence data. The 210 by PCR bands were detected with annealing temperature $48^{\circ}C$. The 18S 2F-18S 4R detection primer set distinguished P. linteus from various Phellinus species but some species like P. baumii, P. weirianius, P. rhabarberinus and P. pomaceus also had weak reactivity on this primer set. The 18S 3F-18S 4R primer set distinguished only P. linteus from various Phellinus species, although sensitivity with this primer set was lower than that of 18S 2F-18 4R primer set. These primer sets would be useful for the detection of only P. linteus among unknown Phellinus species rapidly.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권3호
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• pp.323-331
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• 1996

포유동물에 있어서 조기 성 판정기술은 축산에 있어서의 성별 육종프로그램이나 인간의 X-염색체 관련 열성유전병의 산전진단 등 여러 분야에 응용될 수 있다. 초기배에 대한 성 판정은 성염색체에 존재하는 특이한 염기서열을 증폭시키는 polymerase chain reaction (PCR)과 X와 Y 염색체에 대한 특이적 probe를 이용하는 fluorescent in situ hybridization (FISH)에 의하여 수행될 수 있다. 1992년과 93년, 2개년도에 걸쳐 본 연구실에서 돼지의 3.3 kb 웅성특이 DNA 절편(pEM39)을 cloning하였다. 본 연구는 pEM39가 성특이 DNA-probe로 이용될 수 있는지를 조사하기 위해 PCR과 FISH를 이용하였다. 돼지 난자는 도축장에서 구입한 돼지 난소로부터 채취되었고, 체외배양후 체외수정되었다. 한편 처녀발생나자를 negative control로 이용하였다. 2 세포기의 수정란을 선발한 후 PCR을 통하여 DNA를 분석한 결과, 10개의 수정란 중 6개는 자성, 다른 4개는 웅성으로 판정되었으며, FISH를 수행한 결과, done된 웅성특이 DNA 단편은 돼지 간조직과 초기배에서 웅성특이성을 보였다. 또한 FISH와 karyotyping을 수행한 결과 clone된 웅성특이 DNA 단편이 Y 염색체 q-arm의 heterochromatic region에 위치함을 알 수 있었다. 이러한 결과로 보아 clone된 웅성특이 DNA 단편이 초기배의 성을 조기판정하는데 있어 유용하리라 사료되며, PCR에 의한 초기배의 성 판정에 있어 신뢰할만할 지표가 될 수 있을 것이다.

• KSBB Journal
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• 제18권3호
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• pp.190-196
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• 2003

임신이나 배란진단과 같이 가정에서 직접 사용할 수 있는 형태의 membrane strip 크로마토그래피 방법을 이용하여 식중독 균 DNA 분석시스템을 개발하였다. 분석물질로서는 빈번하게 발생하고 있는 식중독 미생물 중에서 S. typhimurium을 선택하였으며, Salmonella 종에 특이한 유전자 부위인 invA 유전자 분석을 목표로 하였다. 우선 이 유전자는 본 실험실 내에서 설계한 primer 쌍을 사용한 PCR 공정을 통하여 증폭되었다. 이렇게 증폭한 산물을 본 연구자들이 설계한 DNA probe와의 hybridization을 통하여 분석함으로써 전통적으로 사용하고 있는 전기영동 분석법의 단순히 분자크기에 의한 분리법과 비교하여 특이한 분석을 할 수 있었다. 이때 PCR 후 과량으로 잔존하는 primer를 별도로 제거하지 않고 hybridization을 수행할 수 있도록 특별하게 DNA probe를 설계하였다. 또한, probe가 증폭된 DNA와 hybridization 하였을 때 고체표면에 의한 간섭효과가 최소화되도록 설계 시 반영되었고 더욱이 streptavidin-비오틴의 결합을 이용하여 probe를 고정함으로써 고상에서의 상호작용이 더욱 용이하도록 배려하였다. 이러한 분석방법을 이용하여 분석한 결과 시료첨가 후 20-40분 정도에 최소 $10^3$cfu/mL (10 cells/system) 농도의 박테리아를 분석할 수 있었다. 이러한 결과는 일반적으로 사용하는 전기영동법보다 약 10배정도 더 민감한 결과일 뿐만 아니라 실험실 기기를 사용하지 않고 분석을 수행함으로써 분석시료가 제공되는 현장에서도 식중독 균의 탐지가 가능하게 되었다.

• 한국균학회지
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• 제26권2호통권85호
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• pp.173-181
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• 1998

현재 우리나라에서 가장 많이 재배되고 있는 느타리버섯류 중 P. ostreatus, P. florida, P. sajorcaju의 3개 종 13개 품종에 대하여 rDNA분석 및 AP-PCR, RFLP를 실시하여 각 종 및 품종들에 대한 구분을 시도하였다. rDNA의 IGRI부위는 약0.9 kb로 증폭되었고, $ITSI{\sim}II$는 약 0.7 kb로 증폭되었다. 각 PCR 산물을 6가지 제한효소로 절단하여 polymorphism을 분석한 결과, $ITSI{\sim}II$ 부위를 HaeIII로 처리시 여름느타리에 특이적인 band를 보였다. 또한 유연관계를 분석하여 종간 차이를 구분할 수 있었다. AP-PCR를 실시한 결과 약 $2.0kb{\sim}150\;bp$의 다양한 band를 볼 수 있었고 P. florida종은 marker로 사용 가능한 특이 밴드가 발견되었다. 또한 사용된 primer에 따라 종간의 구별이 가능하였을 뿐 아니라 품종간에도 차이를 보이는 primer도 찾을 수 있었다. 품종을 구분하기 위한 RFLP 분석에서는 $ITSI{\sim}II$보다 IGRI probe가 더 큰 변이를 보였다.

• 미생물학회지
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• 제44권3호
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• pp.212-220
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• 2008

본 연구는 Prevotella nigrescens ATCC $33563^T$에 대한 균주 특이 DNA 프로브라고 보고된 Pn10 프로브의 균주 특이성을 한국인에서 분리된 P. nigrescens의 임상분리 균주를 이용하여 검증하고, P. nigrescens ATCC $33563^T$ 균주 특이 PCR 프라이머를 개발하고자 시행되었다. P. nigrescens와 유전학적으로 가장 가까운 Prevotella intermedia를 포함한 구강 내 치주질환 원인균종인 5균종의 표준균주 및 참고균주, 그리고 P. nigrescens와 P. intermedia의 임상분리 균주를 이용하여 Southern blot 분석법을 시행하였다. Southern blot 분석 결과 Pn10 DNA 프로브에 P. nigrescens ATCC $33563^T$ 및 ChDC KB6 두 균주 지놈 DNA가 검출되었다. P. nigrescens KB6 균주에서 Pn10 DNA 프로브와 상동성이 있는 부위를 PCR법으로 증폭(KB6-Pn10)하여 클로닝한 다음 Pn10 DNA프로브와 같이 핵산 염기서열을 결정하여 상동성을 비교하였다. 그 결과 Pn10과 KB6-Pn10의 핵산염기서열간의 Percent identity는 98.8%였으며, divergence는 0.6%였다. Pn10 DNA 프로브의 핵산염기서열을 바탕으로 두 중류 프라이머 쌍(Pn10-F-AC/Pn10-R-AC 및 Pn10-F-A/Pn10-R-A)을 설계 및 제작하여 P. nigrescens ATCC $33563^T$에 대한 균주 특이성을 PCR법으로 검증하였다. 이들 프라이머 쌍들의 민감도(sensitivity) 조사 결과, 이들은 P. nigrescens ATCC $33563^T$ 지놈 DNA 4 pg까지 검출할 수 있음을 알았다. 이상의 연구 결과를 종합하면, Pn10 DNA 핵산염기서열을 바탕으로 설계된 Pn10-F-AC/Pn10-R-AC 및 Pn10-F-A/Pn10-R-A 프라이머 쌍들은 P. nigrescens ATCC $33563^T$를 신속 정확하게 검출하는 수 있어, 균주의 보존적 측면에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

• International Journal of Oral Biology
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• 제40권2호
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• pp.103-109
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• 2015

Growing evidence suggests that mitochondrial reactive oxygen species (ROS) are involved in various pain states. This study was performed to investigate whether ROS-induced changes in neuronal excitability in trigeminal subnucleus caudalis are related to ROS generation in mitochondria. Confocal scanning laser microscopy was used to measure ROS-induced fluorescence intensity in live rat trigeminal caudalis slices. The ROS level increased during the perfusion of malate, a mitochondrial substrate, after loading of 2',7'-dichlorofluorescin diacetate ($H_2DCF-DA$), an indicator of the intracellular ROS; the ROS level recovered to the control condition after washout. When pre-treated with phenyl N-tert-butylnitrone (PBN) and 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidene-1-oxyl (TEMPOL), malate-induced increase of ROS level was suppressed. To identify the direct relation between elevated ROS levels and mitochondria, we applied the malate after double-loading of $H_2DCF-DA$ and chloromethyl-X-rosamine (CMXRos; MitoTracker Red), which is a mitochondria-specific fluorescent probe. As a result, increase of both intracellular ROS and mitochondrial ROS were observed simultaneously. This study demonstrated that elevated ROS in trigeminal subnucleus caudalis neuron can be induced through mitochondrial-ROS pathway, primarily by the leakage of ROS from the mitochondrial electron transport chain.

• 식물병연구
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• 제21권1호
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• pp.1-5
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• 2015

A PCR method has been developed for the pathovar-specific detection of Pseudomonas syringae pv. tagetis, which is the causal agent of bacterial leaf spots and apical chlorosis of several species within the Compositae family. One primer set, PSTF and PSTR, was designed using a genomic locus derived from an amplified fragment length polymorphism (AFLP) fragment produced a 554-bp amplicon from 4 isolates of P. syringae pv. tagetis. In DNA dot-blot analysis with the PCR product as probe, a positive signal was identified in only 4 isolates of P. syringae pv. tagetis. These results suggest that this PCR-based assay will be a useful method for the detection and identification of P. syringae pv. tagetis.

• 한국치위생학회지
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• 제6권4호
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• pp.311-324
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• 2006

The purpose of this investigation was to evaluate of the specificity of Fusobacterium nucleatum subspecies-specific DNA probes using dot blot hybridization. To confirm whether the clinical isolates were F. nucleatum or not, 16S rDNA of them were cloned and sequenced. The sequencing data were used in homology search with database of GenBank. When the homology was above 98% compared with the nucleotide sequence of a certain bacteria, it was judged as the same species with the bacteria. 23 strains of F. nucleatum were isolates from subgingival plaque of periodontitis patient. The clinical isolates of F. nucleatum were classified into 10 groups using phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence. F. nucleatum subspecies nucleatum-specific DNA probe Fu4(1.3 kb) reacted with genomic DNAs from 8 type strains of F. nucleatum and it reacted strongly with those from 8 clinical isolates. The Fp4(0.8 kb) reacted with F. nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 and one clinical isolates. Fv35(1.9 kb) and Fs17(8.2 kb) probes reacted with genomic DNAs from F. nucleatum subsp. vincentii ATCC 49256 and F. nucleatum subsp. fusiform ATCC 51190, respectively. Our results showed that it is not enough to evaluate the specificity of F. nucleatum subspecies-specific DNA probes with only dot blot hybridization. Therefore, Southern blot analysis will be necessary to confirm the specificity of F. nucleatum subspecies-specific DNA probes.

• The Plant Pathology Journal
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• 제30권1호
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• pp.51-57
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• 2014

A large-scale oligonucleotide (LSON) chip was developed for the detection of the plant viruses with known genetic information. The LSON chip contains two sets of 3,978 probes for 538 species of targets including plant viruses, satellite RNAs and viroids. A hundred forty thousand probes, consisting of isolate-, species- and genus-specific probes respectively, are designed from 20,000 of independent nucleotide sequence of plant viruses. Based on the economic importance, the amount of genome information, and the number of strains and/or isolates, one to fifty-one probes for each target virus are selected and spotted on the chip. The standard and field samples for the analysis of the LSON chip have been prepared and tested by RT-PCR. The probe's specific and/or nonspecific reaction patterns by LSON chip allow us to diagnose the unidentified viruses. Thus, the LSON chip in this study could be highly useful for the detection of unexpected plant viruses, the monitoring of emerging viruses and the fluctuation of the population of major viruses in each plant.

• Journal of Microbiology
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• 제42권3호
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• pp.216-222
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• 2004

In a previous paper, the ogdH gene that encodes 2-oxoglutarat dehydrogenase was isolated from Salmonella typhimurium. The catalytic N-terminal region in the enzyme was found to be very specific for the Salmonella species. Therefore, the aim of the present study was to detect S. typhimurium in food sources using primers designed for OGDH-l and OGDH-2 which were based on the salmonella-specific region of the ogdH gene. A simple polymerase chain reaction (PCR) detection method was developed to detect low numbers of S. typhimurium in a chicken meat microbial consortium. Using the ogdH-specific primers under stringent amplification conditions and for gene probe analysis, fewer than 100 colony-forming units (CFUs) were detectable when pure cultures were employed. When the PCR assay was run on S. typhimurium-contaminated meat contents, only the positive meat samples containing as few as 200 CFUs reacted to the assay. The method employed for sample processing is simple and it was determined to provide a sensitive means of detecting trace amounts of S. typhimurium-specific sequences in the presence of mixed meat microbial populations. When compared with six representative intestinal gram-negative bacterial strains in foods, including Vibrio parahaemolyticus, V. vulnificus, Enterobacter cloacae, E. coli O157:H7, Pseudomonas aeruginosa, and Proteus sp., S. typhimurium had a unique and distinct PCR product (796 bp). In conclusion, the two OGDH primers were found to be rapid and sensitive detectors of Salmonella spp for the PCR method.