토양으로부터 inulin을 기질로 하여 중합도가 큰 oligo당으로 가수분해하는 새로운 endo형 Inulinase 생산균주로, Arthrobacter sp. S37를 분리, 선발하였다. 본 효소의 생산은 inulin과 돼지감자 추출물에 의해 유도되었으며, 탄소원으로 1.5% 돼지감자 추출물, 유기질소원으로 1.0% yeast extract, 무기 질소원으로 0.5% $NaNO_3$를 사용하였을 때 효소 생산이 가장 많았다. 또한 최적 배양 pH와 온도는 각각 pH 8.0과 $30^{\circ}C$로 나타났다. 최적 배지와 최적 배양 조건하에서 배양한 결과 배양 24시간에 10.8 units/ml로 최대효소생산을 보였다.
토양에서 분리 동정한 Bacillus subtilis K-4-3를 $\beta$-glucanase생산을 위하여 발효조를 사용한 결과 flask내 배양보다 배양 시간을 단축하였고 높은 역가의 조효소액을 얻을 수 있었다. 배양여액으로부터 균체의 $\beta$-glucanase는 색소에 접합된 변형기질을 이용하여 ammonium sulfate, fractionation Sephadex G-100 gel filtration, DEAE-Sphacel ion exchange chromotography의 순으로 정제하였으며, 정제효소는 15배로 정제되어 비활성이 25.7 unit/mg이였으며, 수율은 4.2%이였다. 본 효소의 일반적 특성을 검토한 결과 정제효소는 $50^{\circ}C$에서 최적반응을 나타내었고 그 활성은 $50^{\circ}C$에서 30분간 열처리에도 안정하였다. 효소의 최적 pH는 7.0 부근이었고 금속이온의 영향으로는 $Fe^{3+}$에 의해 강하게 저해받았고 $Li^{+1}$에 의해 약간 활성화 되였다. 분자량은 SDS 전기영동에 의해 17,000.으로 추정되었으며 monomer였다. 또한 본 효소에 의한 분해산불을 TLC로 관찰한 결과 2탄당, 3탄당 빛 4탄당으로 추정되는 분해산물을 얻을 수 았었으나 최종산물인 glucose는 얻을 수 없었다.
Rhizopus oryzae CJ-2114의 polygalacturonase 생성을 위한 최적조건은 수분이 60% 함유된 밀기울 배지에 1% albumin, 0.2% (NH$_4$)$_2$C$_2$O$_4$, 1% sorbitol을 첨가하여 96시간 배양시 최대활성을 나타내었으며, Sep-hadex G-75 및 G-150을 사용한 gel filtration과 DEAE-cellulose에 의한 이온교환 크로마토그라피를 통하여 이 효소를 11.13배 정제할 수 있었고, 수율은 40.3% 였다. 정제효소는 polyacrylamide gel 전기 영동에 의하여 단일밴드로 확인되었으며 분자량은 SDS-polyacryl-amide 전기영동에 의하여 47,000정도로 측정되었다. 효소의 결정구조는 표면이 거친 기둥모양을 형성하고 있었으며 아미노산 조상은 17종류로써 glutamic acid 함량이 198.74mg/g enzyme로 가장 많았다.
A bacterial isolate derived from soil samples near a cattle farm was found to display extracellular phytase activity. Based on 16S rRNA sequence analysis, the strain was named Bacillus sp. T4. The optimum temperature for the phytase activity toward magnesium phytate (Mg-$InsP_6$) was $40^{\circ}C$ without 5 mM $Ca^{2+}$ and $50^{\circ}C$ with 5 mM $Ca^{2+}$. T4 phytase had a characteristic bi-hump two pH optima of 6.0 to 6.5 and 7.4 for Mg-$InsP_6$. The enzyme showed higher specificity for Mg-$InsP_6$ than sodium phytate (Na-$InsP_6$). Its activity was fairly inhibited by EDTA, $Cu^{2+}$, $Mn^{2+}$, $Co^{2+}$, $Ba^{2+}$ and $Zn^{2+}$. T4 phytase may have great potential for use as an eco-friendly feed additive to enhance the nutritive quality of phytate and reduce phosphorus pollution.
자연계로부터 locust bean gum이 들어 있는 선택배지에서 투명환을 형성하는 mannan 분해능을 갖는 미생물을 스크링 하였고 이를 Aeromonas sp. 로 동정하였다. Aero monas sp. 로부터 염색체 DNA를 분리하여 EcoRI으로 절단하여 대장균에 형질전환한 후 대장균 콜로니 주위에서 locust bean gum을 분해하여 투명환을 형성하는 대장균을 찾아냈다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하여 동일한 제한효소를 처리하여 확인한 결과 10 kd의 Aeromonas sp. 염섹체 DNA에 $\beta$-mannanase 유전자 존재하였다. 대장균에서 발현된 $\beta$-mannanase 의최적 반응 pH와 최적 반응온도는 각각 6.0과 $50^{\circ}C$로서 모균인 Aeromonas sp. 와 동일하였다.
한국의 토양에서 분리한 균 중 bacterial $\alpha$-amylase에 저해효과가 있는 균주를 분리하여 DMC-47 균주라 명명하였고, 이 균주는 Streptomyces 속의 균임을 확인하였다. 이 균주를 옥수수 전분 배지에서 진탕 배양한 결과 4일후에 최대 저해 효과를 나타내었다. 이 균주가 생성한 저해물질은 bacterial $\alpha$-amylase, pancreatic $\alpha$-amylase, salivary $\alpha$-amylase, glucoamylase에 저해효과를 보였고, $\beta$-amylase 에는 저해효과가 없었다.
A bacterial strain concurrently producing extracellular chitosanase and chitinase was isolated from soil and identified as a member of the $\beta$-subgroup of Proteobacteria through its 16S rRNA analysis and some biochemical analyses. The newly discovered strain, named as KNU3, had 99% homology of its 16S rRNA sequence with chitinolytic $\beta$-Proteobacterium CTE108. Strain KNU3 produced 34 kDa of chitosanase in addition to two chitinases of 68 kDa and 30 kDa, respectively. The purified chitosanase protein (ChoK) showed activity toward soluble, colloidal, and glycol chitosan, but did not exhibit any activity toward colloidal chitin. The optimum pH and temperature of ChoK were 6.0 and $70^{\circ}C$, respectively. The chitosanase was stable in the pH 4.0 to 8.0 range at $70^{\circ}C$, while enzyme activity was relatively stable at below $45^{\circ}C$. MALDI-TOF MS and N-terminal amino acid sequence analyses indicated that ChoK protein is related to chitosanases from Matsuebacter sp. and Sphingobacterium multivorum. HPLC analysis of chitosan lysates revealed that glucosamine tetramers and hexamers were the major products of hydrolysis.
Park, Sun-Ha;Kwon, Sunghark;Lee, Chang Woo;Kim, Chang Min;Jeong, Chang Sook;Kim, Kyung-Jin;Hong, Jong Wook;Kim, Hak Jun;Park, Hyun Ho;Lee, Jun Hyuck
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제29권2호
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pp.244-255
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2019
Xylose isomerase (XI; E.C. 5.3.1.5) catalyzes the isomerization of xylose to xylulose, which can be used to produce bioethanol through fermentation. Therefore, XI has recently gained attention as a key catalyst in the bioenergy industry. Here, we identified, purified, and characterized a XI (PbXI) from the psychrophilic soil microorganism, Paenibacillus sp. R4. Surprisingly, activity assay results showed that PbXI is not a cold-active enzyme, but displays optimal activity at $60^{\circ}C$. We solved the crystal structure of PbXI at $1.94-{\AA}$ resolution to investigate the origin of its thermostability. The PbXI structure shows a $({\beta}/{\alpha})_8$-barrel fold with tight tetrameric interactions and it has three divalent metal ions (CaI, CaII, and CaIII). Two metal ions (CaI and CaII) located in the active site are known to be involved in the enzymatic reaction. The third metal ion (CaIII), located near the ${\beta}4-{\alpha}6$ loop region, was newly identified and is thought to be important for the stability of PbXI. Compared with previously determined thermostable and mesophilic XI structures, the ${\beta}1-{\alpha}2$ loop structures near the substrate binding pocket of PbXI were remarkably different. Site-directed mutagenesis studies suggested that the flexible ${\beta}1-{\alpha}2$ loop region is essential for PbXI activity. Our findings provide valuable insights that can be applied in protein engineering to generate low-temperature purpose-specific XI enzymes.
토양에서 분리된 pectinase 생산균 strain KL34를 이용하여 폐섬유소의 효소학적 당화에 관한 연구를 수행하였다. 섬유소폐기물을 이용한 효소생산에서 폐야채보다는 과일껍질을 기질로 사용했을 때 높은 효소활성을 보여주었으며, 과일껍질 1.0%(w/v)를 기질로 사용했을 때 3.8U/ml의 pectinase활성을 얻을 수 있었다. 폐야채와 과일껍질을 기질로 사용하고, 5U/ml의 pectinase 활성을 가지는 배양 상등액을 사용하여 효소학적 당화를 수행한 결과 사과껍질 10%를 기질로 사용했을 때 7.1%의 당화율을 얻을 수 있었으며, 이때 생산된 환원당은 9.5g/L였다. 또한 생산된 효소액을 음식물 쓰레기의 당화에 적용하여 pectinase의 사용 가능성을 검토한 결과 KL34의 배양 상등액과 cellulase를 함께 사용한 당화액에서 12.7g/L의 환원당을 얻어, cellulase만을 사용했을 때 보다 1.6배의 당화효율을 얻을 수 있었다.
토양에서 inulin으로부터 di-D-fructofuranose dianhydride(DFA)를 생산하는 inulin fructotransferase를 생산하는 균주로 Enterobacter sp. S45를 선발, 분리하였다. 본 효소에 의하여 생산되는 DFA는 $^13C-nmr$과 HPLC로 분석한 결과 fructose 두 분자가 $\beta$ 1,2': $\alpha$ 2,3' 결합을 한 DFA III로 동정되었다. 본 균주는 탄소원으로 inulin, 유기질소원으로 corn step liquor, 무기질소원으로 $NH_4H_2P0_4$를 사용할 때 효소생산이 가장 많았으며 이 조건하에서 72시간 배양으로 최대 효소생산을 보였다. 균 배양중 배양액내에 DFA III가 생성되었다가 소멸되는 것으로 보아 균체내에 DFAIII를 분해, 이용하는 효소가 존재한다고 추정되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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