• 한국수정란이식학회지
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• 제20권2호
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• pp.105-112
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• 2005

본 연구는 재래산양에서 복제 수정란의 생산효율을 향상시키기 위한 기초 자료를 제시하고자 체세포 핵이식을 실시하여 공핵세포의 종류, 핵이식란의 활성화 처리 방법 및 수핵난자의 조건이 체외발달율에 미치는 영향을 조사, 검토하여 핵이식란 생산을 위한 최적의 조건을 규명하고자 실시하였다. 공핵세포의 종류에 따른 핵이식란의 체외발달율은 융합이 이루어진 핵이식란의 활성화 처리 후 분할율은 귀 유래 섬유아세포를 공핵세포로 사용하였을 때가 $40.5\%$로서 태아 유래 섬유아세포를 공핵세포로 사용하였을 때의 $55.5\%$와 유의적인 차이가 없었다. 또한 상실배 또는 배반포기로의 발달율도 각각 $6.7\%$ 및 $16.0\%$로서 유의적인 차이가 없었다. 핵이식란의 활성화 방법에 따른 체외발달율은 ionomycin+6-DMAP 처리를 하였을 때 분할율은 $79.0\%$로서 전기자극을 주었을 때의 $9.5\%$보다는 유의적(P<0.05)으로 높았다. 상실배 또는 배반 포기로의 발달율도 ionomycin+6-DMAP 처리를 하였을 때는 $15.6\%$가 발달하였으나, 전기 자극을 주었을 때는 4-세포기 이후로의 발달이 전혀 이루어지지 않았다. 체세포 핵이식란은 단위발생란에 비하여 분할율$(66.1\%\;vs\;59.18\%)$ 및 상실배 또는 배반포배로의 발달율$(19.0\%\;vs\;0.0\%)$이 유의적 (P<0.05)으로 낮았다. 단위발생란의 분할율은 체내 성숙난자에서 $86.8\%$로서 난포란의 $69.0\%$보다는 유의적(P<0.05)으로 높았다 단위발생란의 상실배 또는 배반포기로의 발달율에 있어서도 체내 성숙난자$(50.0\%)$가 난포란$(23.6\%)$보다 유의적 (p.<0.05)으로 발달율이 높았다. 이상의 결과로 볼 때 재래산양의 체세포를 이용한 복제수정란의 생산효율을 향상시키기 위해서는 다수의 난자 확보를 위한 과배란처리 방법의 개선, 난포란의 이용효율 개선 및 활성화 처리방법 등이 확립되어야 하며, 후기배로의 발달율 향상을 위해서는 최적의 체외 배양조건 확립이 시급한 것으로 생각된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권2호
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• pp.137-146
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• 2006

본 연구는 공여 세포의 종류, 수핵 난자의 유래 및 수란 산양 발정 동기화 조건이 복제 산양 생산에 미치는 영향을 알아보고자 실시되었다. 공여 세포는 귀 유래 섬유아세포를 분리 배양하여 사용하였으며, 체내 성숙 난자는 성숙한 미경산 재래 산양에 과배란을 유기하여 외과적인 방법으로 난관 관류를 통해 회수하였으며, 배란이 되지 않은 난포란은 난포로부터 흡입 채취한 후, 22시간 동안 체외 성숙을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 zona drilling 후, 극체와 세포질 일부분 제거를 통해 제핵을 실시하고, 핵이 제거된 난자의 위란강 내로 공핵 세포를 도입하여 실시하였다. 핵이식란의 융합은 전기 자극 방법으로 실시되었으며, 융합이 완료된 핵이식란의 활성화처리는 핵이식 3시간 후에 Ionomycin과 6-DMAP를 병용 처리하여 실시하였다. 복제 수정란의 체외배양은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액으로 $2{\sim}4$ 세포기까지 체외 배양을 실시한 다음 수란 산양의 난관에 외과적으로 이식하였다. 임신 진단은 초음파 임신 진단기로 이식 후 제 30일과 60일에 실시하였다. 귀세포를 공핵 세포로 사용하였을 때 융합율이(63.8 VS. 26.5%) 태아 세포를 사용했을 때보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 총 102개의 복제 수정란을 20두에 이식하였으며, 30일에 4두(20.0%)가 임신하였으며 이중 1두가 1두의 복제 산양을 생산하였다. 수란 산양과 공란 산양간의 발정 동기화 간격(${\pm}0$ 또는 +12시간)별 수태율은 각각 18.2 및 16.7%로서 유의적인 차이가 없었다. 수란 산양의 발정 유기 방법에 따른 수태율에 있어서 CIDR 제거 후 hCG 및 PMSG를 투여하였을 때는 25%가 수태하였으나, hCG만 투여한 수란 산양은 수태가 되지 않아 인위적으로 발정 동기화된 수란 산양을 이용하였을 때는 산자를 생산하지 못했다. 자연 발정 산양의 경우, 발정이 동기화된(${\pm}0$) 수란 산양 1두에 체내 성숙 난자를 수핵란으로 사용하여 생산한 5 개의 복제 수정란을 이식하여 149일만에 국내에서 처음으로 복제 산양(진순이) 생산에 성공하였다. 체외 성숙 난자를 수핵란으로 사용하여 생산된 복제 수정란 5개를 이식하였으나 수태가 이루어지지 않았다. 이상의 결과로 볼 때 재래 산양의 체세포 핵이 식에 의한 복제 산자 생산에서 보다 효율성을 높이고 수태율을 향상시키기 위한 조건은 체내 성숙 난자를 수핵 난자로 이용하여 공란 산양과 발정이 동기화된(${\pm}0$) 자연 발정 수란 산양에 복제 수정란을 이식하는 것이 바람직한 것으로 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제25권4호
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• pp.416-424
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• 2015

피노실빈은 소나무 등에서 흔히 관찰되는 스틸벤노이드이다. 혈관내피세포에서 ~pM에서 ~nM 정도의 낮은 농도의 피노실빈은 세포성장, 세포이동, 항염증반응을 유도한다. 그러나 최근에 고농도의 피노실빈이 소 대동맥 내피세포의 세포사를 유발하고 있음이 보고되었으나, 그 자세한 기전이나 경로 연구가 미흡하여 이번 연구에서 고농도 피노실빈의 세포사 유발 경로를 규명하기 위한 실험을 수행하였다. 고농도의 피노실빈은 caspase-3 절단, 포스파티딜 세린의 플립플롭, 핵 분절 등을 유도하는 것으로 보아 세포사멸을 통한 세포사를 유발함을 알았다. 또한 혈청기아나 100 μM etoposide에 의하여 촉발하는 caspase-3 활성/핵분절이 추가적으로 증가하는 현상이 관찰되었다. 이는 피노실빈이 일으키는 세포사멸은 혈청기아나 etoposide에 의해 일어나는 세포사멸과는 다른 경로로 진행됨을 의미하므로 고농도의 피노실빈에 의해 촉발되는 세포신호전달을 탐색한 결과, JNK와 eNOS가 관여함을 알았다. 두 신호전달 물질 중에 어느 것이 피노실빈 유도 세포사에 중요한 지를 알기 위한 추가적인 실험을 진행하였다. 그 결과, JNK 억제자인 SP-600125는 피노실빈에 의한 세포사멸을 억제하였으나, eNOS 억제자인 L-NAME은 아무런 영향이 없는 것으로 보아 JNK가 피노실빈에 의해 유발되는 세포사멸에 관여하는 세포신호 전달물질임을 알았다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제18권3호
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• pp.171-178
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• 2003

복제수정란 생산에 있어서 수핵란 내 체세포 주입 후 전기적인 융합은 필수과정인데, 이 과정을 거치는 동안 많은 수의 체세포 주입 난자가 융합에 실패하거나 lysis가 일어나게 된다. 본 실험에서는 한우 체세포를 이용하여 핵이식을 실시한 후 수핵세포질과 응합을 시도할 때 전기융합 방법에 따른 융합율과 배발달율을 검토하고자 실시하였다. 공여세포는 한우 귀 세포조직을 채취하여 0.05% trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리한 후 DMEM 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식을 위하여 체외성숙시킨 난자를 탈핵용 micro pipette을 이용하여 투명대를 절개하고 수핵 난자의 극체 와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식 수정란은 직접, 간접적인 전기적 자극으로 융합을 실시한 후 calcium iono-phore와 6-DMAP를 이용하여 활성화를 유도하였다. 활성화된 수정란은 38.5$^{\circ}C$, 90% $N_2$, 5% $CO_2$로 조정된 배양기에서 처음 3일은 0.3% BSA가 첨가된 CR1-aa 배양액에서, 배양 4일째부터는 10% FBS가 첨가된 CR1-aa 배양액에서 배양을 실시하였다. 본 연구결과를 요약하면 다음과 같다. 전기자극 융합방법에 따른 수핵난자의 융합율과 lysis율은 electric chamber를 이용하여 간접융합을 실시하였을 경우 51.6%와 10.7%를 보였고, needle을 이용하여 직접 융합을 실시하였을 경우 68.9%의 융합율과 11.5%의 lysis율을 보임으로써 needle을 이용한 직접융합 방법이 유의적으로 높은 융합율을 보였다(P<0.05). 융합 후 체외 발달과정을 살펴보면 난할율에 있어서 needle을 이용했을 시 80.3%로 chamber를 이용했을 시 73.2%보다 유의적으로 높은 난할율을 보였다. 초기배 발달단계인 2∼4세포기의 발달율 역시 needle을 사용한 구가 61.1%로 chamber를 사용한 구 54.1%보다 유의적으로 높은 차이를 보였다. 상실배 단계는 chamber를 사용한 구가 6.7%로 needle을 사용한 구 6.2%보다 약간 높았지만 유의적인 차이는 없었다. 하지만 이식 가능한 단계인 배반포배 발달율에 있어서는 needle을 사용하여 융합을 시도한 구가 26.3%로 chamber를 사용한 구 18.4%보다 유의적으로 높은 발달율을 보였다(P<0.05). electric chamber를 이용하여 전기융합을 시도시전류가 흐르는 wire와 주입된 체세포가 직각을 이루도록 정렬을 시키느라 많은 시간이 소요되고, 주입한 체세포가 세포질과 떨어진 난자는 전기자극을 주어도 융합이 일어날 수 없으며, 높은 전압을 사용하기 때문에 융합된 복제란의 lysis가 많이 발생하는게 가장 큰 단점으로 꼽을 수 있다. 하지만 미세조작기와 needle 방법을 이용하면 낮은 전압을 이용하여 융합을 시도하기 때문에 복제란의 lysis를 줄일 수 있고, 전극과 체세포 주입란을 정렬시키는 과정이 생략되어 시간이 절약되며, 결정적으로 주입된 체세포가 세포질과 떨어져 있더라도 미세조작기로 약간의 압력을 가하여 전기자극을 가할 수 있어서 보다 높은 융합율과 배반포배 발달율을 얻을 수 있기 때문에 needle을 이용한 직접적인 전기융합 방법이 체세포 복제수정란 생산에 효과적이라고 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권2호
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• pp.125-132
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• 2002

본 연구는 돼지 복제수정란의 생산성 향상에 기여하기 위한 기초연구로써 핵이식 수정란의 융합과 활성화 과정에 있어서 전기적 조건이 핵이식 수정란의 융합 및 체외발달에 미치는 요인들을 조사하기 위하여 실시하였다. 공여세포는 Landrace종의 귀 세포조직을 채취하여 0.05%의 trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리하여 TCM-199 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 laser system으로 투명대를 drilling하여 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식 수정란은 전기적 자극으로 융합과 활성화를 실시하여 분할을 유도하였다. 분할이 이루어진 핵이식 수정란은 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액으로 $CO_2$ 배양기에서 6~8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 발달을 유도하였다. 본 연구결과에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1.90kv/cm, 30$\mu$sec 1회의 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 핵이식 수정란의 융합율은 1.90kv/cm의 조건이 49.5%로써 2.10kv/cm(25.8%)와 2.50kv/cm(30.3%)의 조건보다 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 융합 후 활성화가 유기된 핵이식 수정란의 분할율은 2.50kv/cm 전기자극이 70.3%로써 가장 높게 나타났다. 핵이식 수정란을 30$\mu$sec 동안 1회와 2회의 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 융합율은 모두 50%였으며, 60$\mu$sec 동안 1회와 2회의 조건에서도 각각 58.4%와 50.8%로써 전기의 자극시간과 횟수에 따른 차이는 없었다. 융합이 이루어진 핵이식 수정란의 전기활성화 유도 후 융합시의 전기적 조건에 따른 분할율은 30$\mu$sec동안 1회와 2회에 있어서는 49.1%와 56.5%로써 차이가 없었으나, 60 $\mu$sec 동안 2회(76.3%) 실시하였을 경우에는 1회(56.1%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 높은 분할율을 보였다. 전기자극 후 융합이 이루어진 융합란의 분할율은 1.50kv/cm의 전기적 활성화 조건에서는 72.8%로써 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 단위발생란의 분할율 60.9%와는 차이가 없었다. 핵이식 수정란의 배반포기로의 발달율은 1.50kv/cm의 융합조건에서는 9.8%가 배반포기로 발달하였으나, 1.25kv/cm 조건에서는 배반포기로의 발달이 전혀 없었다. 단위발생란의 배반포기로의 발달율은 6.4%로써 핵이식란(1.5kv/cm)과 유의적(P<0.05)인 차이가 없었다. 이상의 결과를 볼 때 핵이식 수정란의 배반포기로의 발달은 융합 및 활성화 과정에 있어서 세포종류, 전기자극의 세기 및 통전시간 등이 영향을 미치는 것으로 생각되며, 돼지 핵이식 수정란의 전기적 융합조건은 1.90kv/cm, 60$\mu$sec., 2회, 융합란의 활성화 조건에 따른 배반포기로의 발달율은 1.50kv/m가 적합한 것으로 생각된다. 따라서 적정 전기적 융합 및 활성화 조건을 확립한다면 핵이식 수정란의 융합율과 체외발달율을 보다 더 높일 수 있을 것으로 생각된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권2호
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• pp.127-132
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• 2004

본 연구는 재래산양의 핵이식을 실시하여 공여세포의 조건, 전기적 세기 및 융합횟수 등이 융합율과 체외발달율에 미치는 영향을 조사하여 최적의 융합조건을 확립하고자 실시하였다. 공여세포는 귀 유래 섬유아세포와 태아 유래 섬유아세포 2종류를 분리 배양하여 사용하였으며, 수핵란의 채취는 성숙한 미경산 재래산양에 과배란을 유기하여 hCG 투여 후 제 35시간째에 외과적인 방법으로 in vivo (체내성숙)난자는 난관을 관류하는 방법으로 회수하고 in vitro (체외성숙)난자는 난포로부터 흡입하여 난포란을 채취하여 약 22시간 체외성숙을 실시하였다. 수핵난자는 난구세포를 제거한 다음 0.05 M sucrose를 처리하여 세포질이 양호하고 극체가 뚜렷하게 보이는 난자만을 선별하여 핵이식을 실시하였다. 핵이식란의 융합은 전기자극방법으로 융합을 실시하였으며, 핵이식 조작 후 약 3시간 동안 전배양을 실시한 다음 활성화를 유도하였다. 복제수정란은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액으로 6∼7일 동안 체외 배양을 실시하였다. 귀 유래 섬유아세포를 공여세포로 사용하였을 때 융합율은 60.4%로서 태아 유래 섬유아세포의 40.3%보다는 높게 나타났다. 분할율에 있어서는 귀 유래 섬유아세포와 태아 유래 섬유아세포가 각각 47.6 및 48.2%로서 차이가 없었다. 2.40∼2.46 ㎸/cm로 전기자극을 주었을 때 융합율은 43.8%로서 1.30∼l.40 ㎸/cm(26.7%)와 2.30∼2.39 ㎸/cm (34.8%)가 높게 나타났으며, 융합이 이루어진 핵이식란의 분할율은 82.9(1.30∼l.40 ㎸/cm), 43.8(2.30∼2.39 ㎸/cm) 및 51.8%(2.40∼2.46 ㎸/cm)로서 전기자극의 세기에 따른 유의적(p＜0.05)인 차이는 없었다. 전기융합을 1회 실시하였을 때 in vivo 난자는 43.5%로서 in vitro 난자의 23.6%보다 유의적으로 높게 나타났으며, 2회 실시하였을 때는 55.7(in vivo) 및 39.2%(in vitro)로 in vivo에서 높게 나타났다. 3회 자극을 주어 전체 융합율은 in vivo가 66.1%로서 in vitro의 52.8%보다는 유의적으로 높게 나타났다.