비변성 폴리아크릴 아미드 겔에서 Streptomyces coelicolor 의 catalase 활성 염색을 실시하여 여러개의 catalase 활성 띠를 관찰하였으며, 그 유형이 성장기에 따라 달라짐을 알았다. 포자와 정체 성장기에는 정체 성장기에만 특이적인Cat1(760kD) 이 관찰되었고, Cat2(300kD) 를 제외한 모든 활성 띠들이 나타났다. 중기 대수 성장기에는 Cat2 와 Cat 3-2, Cat3-2(140kD) 등 2개의 catalase 띠가 나타나며, 후기 대수 성장기에는 Cat3-1(170 kD), Cat3-2, Cat3-3(130kD). Cat4(70kD)등의 활성 띠가 나타났다. NTG 처리로 돌연변이화된 S. coelicolor 의 포자를 Bennet 평판 배지네서 배양한 후 과산화수소 거품 test 를 실시하여, 약 5000 여개의 콜로니 중 거품형성 속도나 양이 감소한 콜로니를 12개 얻었다. 야생형에 견주어 대부분 catalase 활성이 감소하였으며, 대수 성장기와 정체 성장기에서 모두 감소하였다. 거품형헝을 하지 않는 모든 돌연변이에서 Cat3-2 띠의 강도라 현저히 약해저 있음으로 보아 Cat3-2가 주된 catalase 인 것으로 추정된다. 대수 성장기에서 수확한 S. coelicolor 세포 추출액에서 Sepharose CL-4B, DEAE Sepharose CL-6B, Phenyl Sepharose CL-4B, Hydroxylapatite 크로마토그래피등 4단계의 크로마토그래피를 수행하여 Cat3-2 를 정제하였다. 비변성 폴리아크릴마드 겔 전기 영동을 수행한 결과 Cat3-2 는 67 kD 의 동일한 subunit 을 2개 가지고 있는 효소로 추정된다.
식용버섯으로부터 항보체 활성물질을 탐색하여 새로운 소재화 연구의 일환으로 상황버섯(Phellinus linteus) 균사체로부터 항보체 활성 물질을 분리, 정제를 하였으며 화학적 특성을 검토하였다. 정제는 상황버섯의 열수추출한 후, 열수추출물(PL-0)를 한외여과하여 분자량별로 5개의 획분을 얻었다. 이 중, 300kDa 이상의 획분(PL-5)을 DEAE-Sepharose FF 이온교환 크로마토그래피, Sepharose CL-4B 겔여과 크로마토그래피를 실시하여 PL-5-IIIa 획분을 얻었다. PL-5-IIIa 획분을 HPLC를 행한 결과 단일 피크로 나타났으며 정제다당 PL-5-IIIa의 분자량은 800,000Da으로 측정되었다. 정제다당 PL-5IIIa는 64.2%의 당과 29.6%의 단백질로 구성되었으며 구성당은 galactose가 43.1%, mannose가 40.6%, fucose가 15.8%로 나타났다.
Bacillus subtilis PANH765 균주가 생산하는 pretense를 황산암모늄에 의한 염석, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, Sephacryl S 200 HR 및 Sepharose CL-6B gel filtration을 이용하여 정제하였다. DEAE-cellulose ion exchange chromatography를 행한 결과, 흡착 단백질 부분에서 활성이 높은 분획을 얻었다. 이 분획을 Sephacryl S 200 HR 및 Sepharose CL-6B gel filtration을 행한 결과 protease 활성을 가지는 단일 분획을 얻을 수 있었다. 정제한 protease의 분자량을 SDS-PAGE와 Sepharose CL-6B gel filtration으로 측정한 결과, 분자량은 35.0 kDa으로 추정되었으며, 각 효소의 비활성도는 6.27 U/mg이었으며, 회수율은 각각. 28.0%, 정제도는 4.35배로 나타났다. 최적 반응 온도는 $65^{\circ}C$, 최적 반응 pH는 7.05로 나타났으며, 온도 안정성은50 ∼ 75$^{\circ}C$, pH 안정성은 6.0 ∼ 7.5로 나타났다. 금속 이온의 영향은 $Na^{+}$, $K^{+}$, $Mg^{2+}$ 및 NH$_4$$^{+}$ 이온이 효소 활성을 촉진하였으며, 그 중에서 $Mg^{2+}$가 119.5%로 가장 높게 나타났다. 저해제인 경우 PMSF및 DFP에 의해 저해되었고 특히 DFP 보다는 PMSF 첨가시 뚜렷한 저해를 나타내었다.
해양세균 Pseudomonas sp. CHCS-2는 배양과정 중에 포도당 첨가에 의해 생물유화제의생산이 증가되었으며, 196시간 배양시 원유에 포함되어 있는 paraffine계 탄화수소 중에서 $_nC_{12}~_nC_{22}$까지 범위의 carbonchain이 거의 대부분 분해됨을 알 수 있었다. chloroform : metahnol = 1 : 1(V/V)로 추출하여 얻은 8.5g/L의 crude 생물 유화제를, Amberlite XAD-7, Sepharose CL-4B, DEAE-sepharose CL-6B 수지를 사용하여 정제한 결과 최종적으로 0.21g/L의 정제된 생물유화제를 얻었다. 본 균주가 생산하는 생물유화제는 단백질과 octadecanoic acid가 결합된 분자량이 약 67kDa인 lipoprotein으로 확인되었으며, 정재된 생물유화제중 단백질성분만을 분리하여 N-말단 아미노산배열을 분석한 결과, Ser-Val-He-Asn-Thr-Asn-IIe-Thr-X-Met-Ile-Gly-Gin-Gln-의 배열을 가지는 것으로 확인되었다. 이는 기존에 보고된 lipoproten과 다른 형태의 것으로, 본 균주가 생산하는 생물유화제의 경우 구성성분, 분자량 등을 고려해 볼 때 새로운 형태의 lipoprotein 계열 생물유화제로 추정된다.
찰흑미(상해항혈나)에서 열수가용성 물질과 열수불용성 물질을 분리하여 그 전분의 겔 크로마토그래피 용출양상을 조사하였다. 열수가용성 물질은 찰흑미 전분이 16.6%,신선찰벼 전분이 13.4%였으며, 열수가용성 물질의 Sepharose CL-2B에 의한 용출양상은 두 시료 모두 void volume 부근에서 대부분 용출되었고, 열수가용성 물질에 대한 요오드복합체의 최대흡수파장은 신선찰벼 전분과 찰흑미 전분이 각각 522 nm와 520 nm로 생 전분에서의 요오드반응과 비교하여 약간의 이동이 있었다. 열수불용성 물질의 Sepharose CL-2B에 의한 용출양상은 열수가용성 물질의 용출양상과 서로 비슷하였으며 요오드복합체와의 최대흡수파장은 열수가용성 물질보다 낮았다.
An oxygen-sensitive fumarate reductase has been purified from the cytosol fraction of the Enterococcus faecalis RKY1 grown anaerobically on a defined medium containing glycerol and fumarate. A major portion of the purification was performed with employing Triton X-100 and reducing agents by Phenyl-sepharose CL-4B DEAE-sepharose and Dephadex G-150 The final activity was 0.42 unit/mg. The deduced molecular mass of active band was 66 kDa. The optimal pH and temperature for the activity were 7.0 and 38$^{\circ}C$ respectively. The enzyme activity was not affected by 1mM metal ions such as bacl2 $.$2H2O HgCl2 MnCl2$.$4H2O ZnCl2 CuCl2$.$2H2O Mgcl2$.$6H2O FeSo4$.$7H2O and by EDTA. Partially purified enzyme ws yellow in color ; spectroscopic study indicated the presence of flavins as a cofactor.
The endo-1,4-${\beta}$-xylanase was extracted and purified from the extracellular xylanolytic systems of Trichoderma viride. The crude enzyme was chromatographed with ion-exchange reins of DEAE Sepharose CL-6B, Sepharose, S-Sepharose CL-6B and the resulting xylanase was turned out to be a single protein as 20KD hy SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The xylooligomers were obtained from xylan by incubation with the purified xylanase up to 50%. The ${\beta}$-xylosidase lost its activity completely by incubation of crude enzyme for 24hr with buffer solution of pH 2.8 at $27^{\circ}C$. And also, the xylooligomers were obtained from xylan as a main product by incubation with the crude enzyme treated with acidic buffer.
A partially purified preparation of L-galactonolactone oxidase which catalyzes the last step of L-ascorbic acid biosynthesis was obtained from Saccharomyces cerevisiae ATCc 26787. The purification procedures included Triton X-100 treatment, protamine sulfate precipitation, ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose CL-6B ion exchange chromatography, Sephadex G-150 gel filtration chromatography, and Phenyl-Sepharose CL-4B hydrophobic interaction chromatography. The optimum temperature for the enzyme activity was about $34^{\circ}C$ and the optimum pH was 6.8-7.0. The substrate specificity was confined to L-aldonolactones, L-galactono-1,4-lactone and L-gulono-1,4-lactone. An apparent Km value of 0.294mM with L-galactono-1,4-lactone as a substrate was found. By comparing the substrate specificities of this enzyme with those of isofunctional enzymes of higher plants and animals, it becomes evident that the enzyme of S. cerevisiae ATCC 26787 is rather similar to the L-gulonolactone oxidase of animals than the galactonolactone dehydrogenase of higher plants.
For purification of a 70kDa toxic protein of mosquitocidal delta-endotoxin from B. thuringiensis strain H9B, immuno-affinity chromatography was performed. After separation of 70kDa toxic proteins from the delta-endotoxin of the strain H9B on SDS-PAGE, the 70kDa toxic protein was subcutaneously injected into rabbit for making a polyclonal antibody. A anti-70kDa toxic protein was purified by a column chromatography packed with protein A-sepharose 4B gels. The 70kDa toxic protein from delta-endotoxin of the strain H9B was also purified by an immuno-affinity chromatography packed with CNBr-activated sepharose 4B gels conjugated anti-70kDa toxic protein after elution with 1/10M citric acid-1/5M Na$_{2}$HPO$_{4}$ buffer(pH3.2) containing 0.5M NaCl. The 70kDa toxic protein was purified through only one step-separation system, was demonstrated by SDS-PAGE and immunoblot.
Valencia 오렌지로부터 추출한 펙틴에스테라제(pectinesterase, PE) 중에서 가열처리하지 않은 PE 조효소를 CM-Sephadex C-50, Phenyl Sepharose CL-4B와 CM-Biogel A의 chromatography를 차례로 수행하여 내열성이 약한 TLPE(thermolabile pectinesterase)와 내열성이 강한 TSPE(thermostable pectinesterase)를 분리 정제하였다. PE 중에서 가열처리한 PE 조효소에서는 위와 같은 정제과정으로 TSPE 만을 분리하였다. TLPE는 비활성 1,005 units/mg이고 35배로 정제된 것을 13.6% 회수할 수 있었으며, 반면에 가열하지 않고 분리한 TSPE는 비활성 3,115 units/mg이고 100.5배로 정제된 것을 1.5% 얻을 수 있었으나 가열하여 분리한 TSPE는 비활성 1,803 units/mg이고 가열처리한 조효소가 140배로 정제된 것을 15.4% 얻을 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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