Saccharomycopsis lipolytica ATCC 44601 과 MX9-11RX8 온도감수성 변이균주의 isocitrate lyase는 조추출액을 ammonium sulfate 분획, Toyo Peal HW-55F gel filtration, DEAE-Cellulose ion exchange chromatography 등의 방법에 의하여 각각 54배, 87배 분리 정제되었다. 정제효소의 subunit 분자량은 59,000이고 Sephadex G-200 gel filtration에 의한 native enzyme 은 230,000이므로 이 효모의 isocitrate lyase는 같거나 비슷한 subunit 4개로 구성된 tetramer이며, 최적 pH는 6.9이었다.
The effects of media composition on citric acid fermentation using surface immobilized Saccharomycopsis lipolytica were studied. The use of the standard medium for these organisms resulted in rapid decrease of citric acid production and a transformation of immobilized cell morphologies from a yeast-type to a mycelium-type. When the standard medium was enriched with vitamins, trace minerals, a growth factor and ammonium to form a Vigorous Stationary Phase (VSP) fermentation type medium, relatively stable citric acid production (10 mg/lㆍh) was obtained. Using the VSP type medium, the surface immobilized cells also retained their yeast-type form.
Saccharomycopsis lipolytica의 citrate와 isocitrate의 생산에 미치는 itaconate의 영향을 조사하였다. Itaconate는 isocitrate lyase의 활성을 저해하며 저해율은 0.8mM 농도에서 약 80% 이었고, 개열반응에서는 직선적인 불경쟁적 저해를 나타내었으며 저해상수 Ki값은 0.18mM이었다. Itaconate는 glucose 배지에서는 균의 생육에 영향을 미치지 않았지만 n-hexadecane 배지에서는 균의 생육을 심하게 저해하였다. 한편 itaconate의 첨가량을 증가시킴에 따라 총산에 대한 isocitrate의 생산 비율은 n-hexadecane배지에서는 약 80%까지 증가하였으나 glucose배지에서는 거의 변화가 없었다.
S. fibuligera 균주는 생전분을 분해하는 활성이 있는 효모 균주이다. 본 연구에서는 첨가되는 젖산의 농도가 점차 증가하는 장기간 반복 회분식 배양 방법을 사용하는 적응진화를 통하여 S. fibuligera 균주의 젖산에 대한 내성을 증진시키고자 하였다. 진화된 균주인 S. fibuligera MBY1940 균주는 비성장속도 측정과 평판배지를 사용하는 성장분석을 통하여 모균주가 성장할 수 없는 젖산 농도 2.5%에 대해서도 내성을 나타내는 것을 확인하였다. 전자현미경 관찰을 통하여 젖산이 첨가된 스트레스 조건에서 모균주는 신장된 세포 형태와 세포막에 손상을 입은 것으로 보아 진화된 균주에 비해 젖산에 대하여 상대적으로 취약한 것으로 판단되었다.
핵전이에 의해 형성된 잡종의 유도 배양액으로부터 glucoamylase를 정제하고 몇몇의 효소 특성을 조사하였다. 효소는 76배 정제하였고, ammonium sulfate fractionation, Sephadex G-150 gel permeation chromatography 그리고 DEAE-Sephadex A-50 ion exchange chromatography의 순서 배양액으로부터 정제한 결과 전반적인 수율은 16%를 나타내었다. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis와 Sephadex G-150 gel permeation chromatography에 의하여 정제된 glucoamylase의 분자량을 측정한 결과 57.5 kDa를 나타내었으며, 정제된 효소의 최적 pH와 온도는 각각 5.0과 $40^{\circ}C$로 나타났다. 또한 가용성 전분에 대한 Km값은 2.6 mg/ml을 나타내었으며, 정제된 효소는 $Ca^{2+}$, EDTA, $Co^{2+}$, $Mg^{2+}$, 그리고 $Mn^{2+}$의 존재하에 활성이 중진됨을 알수 있었다.
Alkane 효모의 유성(有性) 생활환(生活環)을 이용한 유전적 해석과 대사경로(代謝經路)에 관한 기초자료를 얻고자 토양과 오염된 치이즈에서 citric acid의 생산성이 높은 균주를 분리하여 동정하고 교잡(交雜)에 의하여 2배체(倍體) 체화(體化)하였으며, 이들의 유전적, 생화학적 및 효소학적 특성을 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. Citric acid와 isocitric acid를 생산하는 CJ2, CJ7과 CJ8 균주는 Saccharomycopsis lipolytica의 교배형(交配型) A, B와 B로 각각 동정되어 교잡(交雜)과 포자형성(胞子形成)에 의하여 얻은 배수체(倍數體)의 감수분열(減數分裂) 분리를 행한바 재조합형(再組合型) 자손이 얻어졌다. 모든 균주는 glucose배지보다 n-hexadecane배지에서 재친(再親) 1배체(倍體)보다 2배체(倍體)가 citric acid를 많이 생산하였고 isocitrate Iyase의 비활성(比活性)은 n-hexadecane배지에서 생육한 세포가 glucose배지에서 생육한 세포보다 $15{\sim}20$배 높았지만 citrate synthetase의 비활성(比活性)은 탄소원에 의하여는 거의 영향을 받지 않았다. 또한 이들 효소의 비활성(比活性)과 citric acid의 생산 사이에는 균주와 배수성에 관계없이 상관관계가 적었다.
본 논문은 대체식품 및 화장품 원료로 사용되는 미강을 발효를 통해 기능성과 경쟁력을 증가시키는 것을 목표로 하였다. 미강 추출물과 누룩에서 분리된 Saccharomycopsis fibuligera A8로 발효된 미강 추출물을 이용해 세포독성과 항염효과를 확인하였다. 세포 독성의 경우 미강 추출물의 경우 100 ㎍/mL에서 세포독성을 보였으나 발효 미강 추출물의 경우에는 세포독성을 보이지 않았다. 한편 nitric oxide, IL-6, TNF-α, IL-1β와 같은 염증 지표를 통해 항염효과를 확인한 결과, 미강 추출물은 nitric oxide, TNF-α만 100 ㎍/mL이상의 농도에서 항염효과를 보였다. 발효 미강 추출물의 경우에는 각각 25 ㎍/mL, 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 50 ㎍/mL의 농도에서 항염효과를 보여 더 낮은 농도로 항염효과를 나타내는 것을 확인하였다. 한편 S. fibuligera A8 사균체의 세포 독성 및 항염 효과를 실험한 결과 발효 산물에서 사균체 역시 유효하게 작용하는 것을 알 수 있었다.
본 논문은 대체식품 및 화장품 원료로 사용되는 미강을 발효를 통해 기능성과 경쟁력을 증가시키는 것을 목표로 하였다. 5종류의 누룩에서 분리한 Saccharomycopsis fibuligera 50종의 균주 중 효소 활성이 우수한 6균주와 표준균주를 이용한 발효미강물의 𝛼-amylase, CMCase, 𝛽-glucosidase, protease 등의 효소 활성을 통해 비교한 결과, A8균이 KCTC 7806 균주에 비하여 13.7%, 21.1%, 50.3%, 10.0%의 우수한 효소 활성을 보였다. 발효의 결과지표로서 ABTS, DPPH 검사를 시행한 결과, A8으로 발효한 미강이 KCTC 7806 균주로 발효한 미강에 비하여 1.12배, 1.28배의 항산화능이 있음을 확인하였다. 본 논문으로, S. fibuligera 표준균주인 KCTC 7806 보다 우수한 S. fibuligera A8 균주를 확인할 수 있었다. 또한, 선행연구과제의 항염활성 및 항독성 결과와 더불어 우수한 효소 활성과 항산화능 결과를 통해 S. fibuligera A8 균주를 통한 미강 발효물이 대체식품 및 화장품 원료로서의 기능성과 가격 경쟁력을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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