• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제21권1호
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• pp.11-18
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• 2008

We created a cDNA microarray representing approximately 3,500 pig genes for functional genomic studies. The array elements were selected from 6,494 cDNA clones identified in a large-scale expressed sequence tag (EST) project. These cDNA clones came from normalized and subtracted porcine adipose tissue cDNA libraries. Sequence similarity searches of the 3,426 ESTs represented on the array using BLASTN identified 2,790 (81.4%) as putative human orthologs, with the remainder consisting of "novel" genes or highly divergent orthologs. We used the gene microarray to profile transcripts expressed by adipose tissue of fatty Chinese Xiang pig (XP) and muscley Large White (LW). Microarray analysis of RNA extracted from adipose tissue of fatty XP and muscley LW identified 81 genes that were differently expressed two fold or more. Transcriptional differences of four of these genes, adipocyte fatty acid binding protein (aP2), stearyl-CoA desaturase (SCD), sterol regulatory element binding transcription factor 1 (SREBF1) and lipoprotein lipase (LPL) were confirmed using SYBR Green quantitative RT-PCR technology. Our results showed that high expression of SCD and SREBF1 may be one of the reasons that larger fat deposits are observed in the XP. In addition, our findings also illustrate the potential power of microarrays for understanding the molecular mechanisms of porcine development, disease resistance, nutrition, fertility and production traits.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제25권11호
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• pp.1782-1786
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• 2015

A new improved PCR method has been developed for the rapid, reliable, and sensitive detection of Venturia nashicola, a destructive pathogen of scab disease in Japanese pear. The translation elongation factor-1 alpha gene-derived PCR primers specifically amplified a 257-bp-sized DNA band of the target gene from the genomic DNA of V. nashicola. No amplicon was produced from the genomic DNA of other Venturia spp. and reference fungal species tested. With the high detection limit of 10 fg DNA content, our real-time method could be used for the quarantine inspection and field monitoring of V. nashicola.

• 한국환경과학회지
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• 제18권12호
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• pp.1331-1338
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• 2009

Marine dinoflagellate Alexandrium minutum producing paralytic shellfish toxins is responsible for paralytic shellfish poisoning (PSP). To investigate its temporal distributions in Chinhae Bay where PSP occurs annually, SYBR Green I based A. minutum-specific real-time PCR probe was developed on the LSU rDNA region. Assay specificity and sensitivity were tested against related species, and its specificity was further confirmed by sequencing of field-derived samples. Ten months field survey in 2008 (a total 100 surface water samples) by using the real-time PCR probe showed that A. minutum was detected at very low densities of 1-4 cells $L^{-1}$ in May and June being spring in Chinhae Bay, Korea.

• 대한임상검사과학회지
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• 제46권2호
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• pp.64-67
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• 2014

Vancomycin-resistant Enterococci (VRE) are a leading cause of a nosocomial infection. While seven glycopeptide resistance genotypes have been found in Enterococci, vanA and vanB are the most common resistance genotypes. Aims of this study were to detect antibiotic susceptibilities of 23 Enterococcus spp, which broke out in a university hospital by the disk diffusion test, to investigate specific genes of vanA and vanB by conventional and real-time PCR. PCR for vanA and vanB was performed on 23 Enterococci, all 23 were positive for vanA type. This study reports the validation of a simple and rapid VRE detection method that can be easily incorporated into the daily routine of a clinical laboratory. Early detection of VRE strains, including those with susceptibility to Vancomycin, is of paramount clinical importance, as it allows a rapid initiation of strict infection control practices as well as a therapeutic guidance for a confirmed infection. The real-time PCR method is a rapid technique to detect vanA in Enterococci. It is simple and reliable for the rapid characterization of VRE.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권3호
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• pp.173-181
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• 2008

소의 혈액, 세포, 조직, 기관 등은 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 원료로 널리 사용되고 있다. 소유래 물질을 원료로 사용한 제제의 경우 소유래 원료 물질에 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. BPV는 소에게 가장 흔하게 감염되는 바이러스 중의 하나이다. 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BPV 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPV를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPV 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 BPV real-time PCR 시험법을 확립하였다. BPV에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 BPV DNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time PCR 민감도는 $1.3{\times}10^{-1}\;TCID_{50}/mL$이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성(specificity)과 재현성 (reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 CHO 세포주와 소유래 콜라겐에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. BPV를 감염시킨 CHO 세포에서 세포변병효과를 관찰할 수 없었지만, 세포와 세포배양 상청액에서 BPV를 정량적으로 검출할 수 있었다. 소유래 콜라겐에서도 $1.3{\times}10^0\;TCID_{50}/mL$까지 정량적으로 검출할 수 있었다.

• 식물병연구
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• 제21권4호
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• pp.315-320
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• 2015

Soybean mosaic virus(SMV)는 potyvirus 속에 속하며, 모자이크, 괴사, 기형 등의 병징을 야기하고 국내에서는 11개 계통(G1 to G7, G5H, G6H, G7H, G7a)이 보고되어있다. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) 방법은 등온에서 유전자 증폭이 가능하게 하며, 이 방법은 PCR 과정이나 전기영동 없이도 바이러스에 감염된 식물을 검출할 수 있는 이점이 있다. RT-LAMP의 최적반응 조건은 $58^{\circ}C$, 60분으로 확인되었다. 특이성 검정을 위해 콩에서 발생하는 여러 바이러스들과 보유중인 SMV의 9 계통에서 그 특이성을 확인하였다. 그 결과 SMV에 대한 RT-LAMP primer들의 종 특이성이 확인되었으며, SMV의 계통들에 대해서도 적용이 가능한 것으로 확인되었다. 항온수조와 heating block과 같은 간편한 등온 장치에서 재현성을 확인하기 위해 Thermocycler 기기와 비교하여 증폭 여부를 확인한 결과 반응의 차이는 나타나지 않았다. RTLAMP 반응 이후, 반응물을 전기영동과 SYBR Green I을 이용하여 자연광과 UV광에서 증폭 여부를 확인하였다. 그 결과 전기 영동, 자연광, portable UV light와 UV transilluminator에서 모두 반응이 확인되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권1호
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• pp.12-20
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• 2008

세포배양 유래 생물의약품 생산 공정에서 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. MVM은 동물 세포주와 동물 세포 배양 공정에 오염되는 대표적인 바이러스이다. 세포배양 유래 생물의약품의 MVM 안전성을 확보하기 위해, 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 MVM을 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 MVM 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 real-time PCR 시험법을 확립하였다. MVM에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 MVM DNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양 법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time PCR 민감도는 $6{\times}10^{-2}TCID_{50}/mL$이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성(specificity)과 재현성(reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 MVM을 오염시킨 CHO 세포에서 MVM검출 시험을 실시한 결과 MVM을 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 MVM을 정량적으로 검출할 수 있었다. 또한 바이러스 필터 공정에서 MVM제거 효과를 감염역가 시험법과 비교 검증한 결과 더 높은 민감도로 빠른 시간에 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 위와 같은 결과에서 확립된 MVM real-time PCR시험법은 생물의약품 안전성 보증을 위한 세포주 검증, 생물의약품 생산 공정 검증, 바이러스 제거 공정 검증 등에서 감염역가 시험법을 대신할 수 있는 신속하고, 특이성과 민감성이 우수한 시험법임을 확인하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권1호
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• pp.34-42
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• 2008

소의 혈액, 세포, 조직, 기관 등 소 유래 물질을 원료로 사용한 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제의 경우 소 유래원료 물질에 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. BVDV는 동물세포주, 우혈청 등에 가장 흔하게 오염되는 바이러스이다. 소 유래물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BVDV안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BVDV를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BVDV제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 BVDV real-time RT-PCR시험법을 확립하였다. BVDV에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 BVDV RNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time RT-PCR 민감도는 $1TCID_{50}/mL$이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성 (specificity)과 재현성(reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time RT-PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BVDV를 오염시킨 CHO 세포주와 소 유래콜라겐에서 BVDV검출 시험을 실시하였다. BVDV를 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 BVDV를 정량적으로 검출할 수 있었다. 소 유래 콜라겐에서도 $10TCID_{50}/mL$까지 정량적으로 검출할 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제21권1호
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• pp.100-108
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• 2011

A method for the rapid detection and quantification of Newcastle disease virus (NDV) produced in an animal cell culture-based production system was developed to enhance the speed of the NDV vaccine manufacturing process. A SYBR Green I-based real-time RT-PCR was designed with a conventional, inexpensive RT-PCR kit targeting the F gene of the NDV LaSota strain. The method developed in this study was validated for specificity, accuracy, precision, linearity, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), and robustness. The validation results satisfied the predetermined acceptance criteria. The validated method was used to quantify virus samples produced in an animal cell culture-based production system. The method was able to quantify the NDV samples from mid- or late-production phases, but not effective on samples from the early-production phase. For comparison with other quantifiable methods, immunoblotting, plaque assay, and tissue culture infectious dose 50 ($TCID_{50}$) assay were also performed with the NDV samples. The results demonstrated that the real-time RT-PCR method is suitable for the rapid quantification of virus particles produced in an animal cell-culture-based production system irrespective of viral infectivity.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권10호
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• pp.1616-1621
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• 2007

We have established a SYBR Green-based realtime PCR method using AnyDirect solution, which enhances PCR from whole blood, for direct amplification of the virA gene of Shigella flexneri and the invA gene of Salmonella typhimurium from human feces without prior DNA purification. When we compared the efficiency of conventional or realtime PCR amplification of the virA and invA genes from the supernatant of boiled feces supplemented with S. flexneri and S. typhimurium in the presence or absence of AnyDirect solution, amplification products were detected only in reactions to which AnyDirect solution had been added. The detection limit of real-time PCR was $1{\times}10^4\;CFU/g$ feces for S. flexneri and $2{\times}10^4\;CFU/g$ feces for S. typhimurium; this sensitivity level was comparable to other studies. Our real-time PCR assay with AnyDirect solution is simple, rapid, sensitive, and specific, and allows simultaneous detection of S. flexneri and S. typhimurium directly from fecal samples without prior DNA purification.