In the present study, we investigated temporal variation in the reproductive effort and biochemical contents in adult Manila clam Ruditapes philippinarum at Shi-Heung-Ri beach on the east coast of Jeju Island. Gonad-somatic index (GSI), a ratio of the egg mass to the total biomass determined using ELISA increased dramatically from late May to June (7.1% to 19.5%). In mid-July, GSI dropped to 15.1%, indicating spawning on a small scale during this period. GSI also declined dramatically from late August (15.5%) to September (4.3%), suggesting that massive spawning occurred during this period. A positive correlation was observed between clam size and potential fecundity, while potential fecundity ranged between 1.19-8.40 million eggs/clam. Total proteins and lipids in the tissue increased from late spring to mid-summer, coinciding with an increase in GSI. Protein, lipid and carbohydrate contents in the tissue were lowest in January, indicating that clams were suffering from poor nutritional circumstances, which may be associated with poor food supply from the environment. Monthly increase and/or decrease in the body weight were closely related to gonad maturation and subsequent spawning, which was also linked to temporal changes in the contents of protein, lipid and carbohydrates in the tissue.
갯벌의 건강 수준에 대한 평가는 갯벌에 서식하는 생물의 건강에 의해 평가될 수 있다. 생체지표유전자의 발현 분석을 통하여 갯벌에 서식하는 생물의 건강 수준을 평가할 수 있다. 본 연구의 목적은 heat shock protein 70 (Hsp70), heat shock protein 90 (Hsp90), glutathione S-transferases (GST) 및 thioredoxin (TRX)과 같은 생체지표유전자를 이용하여 서해안 갯벌의 건강을 평가하는 것이다. 이들 유전자는 스트레스, 면역 및 항산화 관련한 유전자들로서 이들 유전자의 발현을 통해 생물의 건강 정도를 관찰하는 데 사용할 수 있다. 본 연구에서는 서해안의 8개 정점에서 바지락(Ruditapes philippinarum)을 수집했다. 유전자의 발현은 RT-qPCR 방법으로 분석하였다. 연구 결과 Hsp70, Hsp90, GST 및 TRX 유전자들의 발현이 8개 정점에서 차별적으로 발현되는 것으로 나타났다. 특히, Hsp90 및 GST의 발현 또는 Hsp70 및 TRX의 발현은 유사하였다. 이것은 각 유전자에 특이적으로 반응하는 물질이 존재하는 것으로 생각된다. 따라서 이화학적 분석결과에 근거하여 분석에 적합한 유전자를 선택할 수 있다고 생각한다. 이 결과는 Hsp70, Hsp90, GST 및 TRX 유전자는 갯벌의 건강을 평가하기 위한 생체지표유전자로서의 역할을 수행함을 시사한다.
백합과 5종에 속하는 유용패류인 살조개, 바지락, 백합, 개조개 및 가무락조개의 체성분에 따른 유사 종간의 근육과 내장에 따른 일반성분 조성을 분석하였다. 분석 결과 근육과 내장의 일반성분의 경우 수분, 조단백질 및 탄수화물은 근육부위에서 내장부에 비해 전체적으로 높은 값을 나타났다. 이러한 결과는 조지방과 탄수화물을 제외한 다른 항목에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다. 조지방의 경우 백합 내장에서 $3.67{\pm}0.57%$로 높게 나타났으며, 바지락 근육에서 가장 낮은 $2.50{\pm}1.40%$를 나타내었다. 탄수화물의 경우 백합의 내장에서 $3.61{\pm}0.45%$ 나타났으며, 바지락과 살조개 내장에서 $3.45{\pm}1.4%$ 및 $3.39{\pm}0.07%$로 높게 함유하고 있었다.
환경오염 평가를 위한 생물지표로 세포내 에너지할당(CEA) 의 적용성을 검토하기 위해 바지락 (Ruditapes philippinarum) 조직을 대상으로 에너지 함량과 에너지 소비율을 분석하였다. 원유를 인위적으로 오염시킨 퇴적물에 바지락을 1, 2, 4, 7, 10 일간 노출 후 일부 조직 (발, 입출수공, 아가미 그리고 몸통) 내 지질, 글루코오스, 단백질 함량, 그리고 전자전달계 (electron transport system, ETS) 활성을 측정하였다. 바지락의 체내 지질, 글루코오스, 단백질 에너지 함량(energy available, EA)은 오염의 수준과 노출시간이 증가함에 따라 감소하였으나, 이와 대조적으로 ETS 활성은 그 반대의 경향을 보였다. 바지락의 조직별 EA는 발 > 입출수공 > 아가미 > 몸통 순이었다. EA와 EC의 분석에서 통계적으로 유의한 차이는 노출 최고 농도 (58.3 mg TPAHs/kg DW) 에서만 발견되었다. 노출 1 일째 발과 아가미에서, 노출 2, 7 일째 몸통에서 EA가 감소하였고, 노출 4 일째 몸통에서 EC가 증가하였다. CEA는 EA 또는 EC 보다 오염에 더 민감하게 반응하였다. 특히, 노출 1-7 일 기간 동안 몸통에서 CEA는 오염 수준이 낮은 (6.5 mg TPAHs/kg DW) 범위에서도 크게 감소하였다. CEA는 급성독성이 나타나지 않는 낮은 수준의 퇴적물오염 평가에서 EA 또는 EC보다 더 민감하였다. 바지락을 이용한 오염 퇴적물 평가시 노출은 4 일간, 그리고 몸통부위에서 CEA를 측정하는 것이 가장 민감하고 신뢰할 수 있을 것으로 여겨진다.
바지락 단백질의 thermolysin 가수분해물로부터 분자량 한계범위가 10,000 da인 한외여과막을 통과한 저분자량의 물질을 Sephadex LH-20 column을 이용한 겔 크로마토그래피에서 ACE에 대하여 저해 활성을 가지는 3개의 획분을 분취하여 SP-Toyopearl 650S column과 SuperQ-Toyopearl 650S column을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 4개의 활성 획분을 얻었다. 이 중 가장 높은 절해 활성을 나타내는 획분의 아미노산 조성은 alanine, leucine, isoleucine 및 threonine의 함량이 많았고, 활성 발현에 있어 C 말단 아미노산 잔기로서 중요한 역할을 하는 proline의 함량도 $3.7\%$%인 것으로 나타났다. ACE 저해 활성은 $IC_{50}$ 값이 0.748 $\mu$g이었다.
바지락, Ruditapes philippinarum의 생식기구를 밝히기 위한 연구의 일환으로서 생식주기는 조직학적 관찰에 의해 조사되었고, 폐각근 조직 및 내장낭 조직 내의 생화학 성분들은 생화학적 분석방법에 의해 조사되었다. 바지락의 생식소 발달에 따른 생식주기는 초기활성기 (1-3월), 후기활성기 (2-5월), 완숙기 (4-8월), 부분산란기 (5-10월), 퇴화/비활성기 (8-2월)의 연속적인 단계로 구분할 수 있었다. 폐각근 조직내 총단백질 함량 (%) 변화는 초기 및 후기 활성기인 2월에 최대에 이른다음 완숙기 및 부분활성기인 5월에 최소값을 나타내었다. 반면, 내장낭 조직 내 총단백질 함량 변화는 완숙 및 부분산란기인 6월에 최대에 이른 후 부분산란기인 6월부터 10월까지 점차 감소되는 경향을 보였다. 전반적으로 폐각근 조직과 내장낭 조직 내의 총단백질 함량 변화 사이에는 음 (-) 의 상관관계를 나타내었다 (r = -0.292, P < 0.05). 폐각근 조직 내 총지질 함량 (%) 변화는 비활성기 및 초기활성기인 1월에 최대에 이른 후, 2월에 급격히 감소되었다. 반면, 내장낭 조직 내 총지질 함량 변화는 후기활성기 및 완숙기인 4월에 최대를 나타내었고, 부분산란기인 5-10 월 사이에 점차 감소되는 경향을 보였다. 전반적으로 폐각근 조직과 내장낭 조직 내의 총지질 함량 변화 사이에는 음 (-) 의 상관관계를 보였다 (r = -0.699, p < 0.05). 폐각근 조직내 글리코겐 함량 (%) 변화는 후기활성기 및 완숙기인 5월에 최대에 이른 다음, 부분산란기인 5월부터 10월까지 급격히 감소되었다. 반면, 내장낭 조직 내 글리코겐 함량 변화는 초기 및 후기활성기인 2월에 최대에 이른 다음, 후기활성기인 3월에 급격히 감소되었으며, 그 후 완숙 및 부분산란기인 4월에서 7월까지 점차 증가되는 경향을 보였다. 전반적으로 폐각근 조직과 내장낭 조직 내의 글리코겐 함량 변화 사이에는 상관관계가 없는 것으로 나타났다(r = 0.062, p > 0.05). 상기 언급된 결과들은 바지락의 폐각근 조직 및 내장낭 조직들이 중요한 에너지 저장소이며, 영양 공급 기관임을 알 수 있었으며, 폐각근 조직과 내장낭 조직들의 영양물질 함량 변화는 생식소의 에너지 요구에 따라 변하고 있음을 알 수 있었다.
바지락의 중금속의 농축 방식 및 해독기작을 연구하기 위해 소화선, 소화관 및 아가미등 세 기관을 선택하여 면역조직화학적 방법, 미세구조적 연구 그리고 SEM-EDS를 사용한 MT와 중금속의 분포 양상을 지역별로 채집한 샘플과 Cd-Cu에 시간별로 노출시킨 샘플에서 각각 살펴보았다. 중금속에 의해 유도된 MT 단백질이 면역조직화학적인 방법에 의해 붉은 색으로 표지되었다. 노출시간이 길어질수록 간췌장에서는 diverticula의 외곽으로 강한 반응을 보였으며, 아가미에서는 중금속의 노출시간이 길어질수록 노출되지 않은 조직에 비해 전반적으로 더 넓은 지역에서 강하게 반응을 보였다. 간췌장과 아가미를 투과전자현미경으로 관찰한 결과 중금속(Cd) 에 더 오래 노출될수록 세포질에서 inclusion body와 중금속으로 추정되는 과립들을 다수 관찰할 수 있었으며, 핵막이 swelling 되는 현상을 관찰할 수 있었다. 또한 발달된 조면 소포체와 미토콘드리아가 관찰되었다. SEM-EDS 결과 중금속의 분포 양상이 지역별로 상당히 상이한 결과를 나타났는데, 이는 지역별로 중금속의 오염정도와 오염원이 되는 중금속의 종류가 다르기 때문으로 추측된다. 그리고 지역별로 채집한 바지락을 이용한 실험과 S와 Zn의 수치가 높게 나타나는 것으로 보아 MT가 관여하고 있음을 간접적으로 확인할 수 있었다.
A peptide inhibiting HIV-1 pretense was isolated from the hydrolysate of manila clam (Ruditapes philippinarum) proteins digested with thermolysin. The peptide was purified by using membrane filtration, gel permeation chromatography, ion exchange chromatography, and reverse phase HPLC, The amino acid sequence of the peptide was determined to be Ile-Tyr-Glu-Gly. This tetrapeptide sequence exists in some proteins of Physarum polycephalum and Mycobacterium smegmatis. Chemically synthesized Ile-Tyr-Glu-Gly showed the $IC_{50}$/ value of 22.3 $\mu$M.
Cathepsins are lysosomal/cysteine proteases belong to papain family (C1 family) that is involved in intracellular protein degradation, antigen processing, hormone maturation, and immune responses. In this study, member of cathepsin family was identified from Manila clam (Mc-Cathepsin D) and investigated the immune response against brown ring disease (BRD) causing Vibrio tapetis challenge. The identified Mc-Cathepsin D gene encodes characteristic features typical for the cathepsin family including eukaryotic and viral aspartyl protease signature domain and two highly conserved active sites ($^{84}VVFDTGSSNLWV^{95}$ and $^{270}IADTGTSLLAG^{281}$). Moreover, MC-Cathepsin D shows higher identity values (-50-70%) and conserved amino acids with known cathepsin D members. Transcriptional results (by quantitative real-time RT-PCR) showed that Mc-Cathepsin D was expressed at higher levels in gills and hemocytes than mantle, adductor muscle, foot, and siphon. After the V. tapetis challenge under laboratory conditions, Mc-Cathepsin D mRNA was up-regulated in gills and hemocytes. Present study indicates that Mc-Cathepsin D is constitutively expressed in different tissues and potentially inducible when infecting BRD by V. tapetis. It is further suggesting that Mc-Cathepsin D may be involved in multiple role including immune response reactions against BRD.
한국환경보건학회 2004년도 International Conference Current Challenges and Advances in Environmental Health
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pp.63-68
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2004
Immunohistochemical and ultrastructural experiments were conducted to find out heavy metal accumulation in some selected organs such as the kidney, the digestive gland, and the gill of the Antarctic clam Laternula elliptica and R. philippinarum. According to the immunohistochemical study the subject organs of the clam showed reactions indicating the presence of MT (metallothionein), a metal-binding protein involved in metal detoxifying process. Examination under the transmission electron microscope also revealed that other ligands may play a role in metal accumulating and detoxifying process in L. elliptica and R. philippinarum. In the artificial exposure of the clam to Cd, the clams showed immediate subcellular responses. The level of the anti-MT reactions became higher in the proportion to the degree of pollution of their habitat and to the period of Cd exposure. These suggest that the two species can be used as efficient biomarkers for Cd exposure in the natural environment.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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