• 생명과학회지
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• 제30권11호
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• pp.931-938
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• 2020

TCTP는 다양한 진핵생물에서 풍부하게 존재하는 단백질 중에 하나이며, 암, 세포 증식, 유전자 조절 등과 관련된 세포의 생리학적 기작에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 왔다. 더구나, TCTP는 dithiothreitol (DTT)나 hydrogen peroxide (H₂O₂)에 의해 유도되는 산화적 스트레스에 대한 저항성에 관여하는 중요한 단백질로 주목 받아 왔다. 한편, 극지역 서식 생물들은 강한 자외선에 의해 발생한 활성산소를 조절하기 위한 다양한 항산화 방어체계를 가지고 있다. 본 연구에서는 북극 동물플랑크톤 Calanus glacialis에서 분리된 TCTP가 산화적 스트레스 하에서 E. coli 세포의 저항성에 미치는 효과를 관찰하였다. C. glacialis에서 분리된 TCTP 유전자(ORF 522 bp) 서열을 분석하였고, 약 23 kDa의 재조합 단백질을 제작하였다. 관찰 결과, TCTP 재조합 단백질이 E. coli 세포에서 과발현 되었을 때, 세포들은 H₂O₂에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 저항성이 증가하는 것을 확인하였다. 본 관찰을 통해, 북극 C. glacialis TCTP 단백질의 항산화 조절자로서의 역할에 대한 가능성을 처음으로 제시하였다.

• Journal of Microbiology
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• 제45권2호
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• pp.158-167
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• 2007

In this study, we have cloned a novel cDNA encoding for a papain-family cysteine protease from the Uni-ZAP XR cDNA library of the polychaete, Periserrula leucophryna. This gene was expressed in Escherichia coli using the T7 promoter system, and the protease was characterized after partial purification. First, the partial DNA fragment (498 bp) was amplified from the total RNA via RT-PCR using degenerated primers derived from the conserved region of cysteine protease. The full-length cDNA of cysteine protease (PLCP) was prepared via the screening of the Uni-ZAP XR cDNA library using the $^{32}P-labeled$ partial DNA fragment. As a result, the PLCP gene was determined to consist of a 2591 bp nucleotide sequence (CDS: 173-1024 bp) which encodes for a 283-amino acid polypeptide, which is itself composed of an 59-residue signal sequence, a 6-residue propeptide, a 218-residue mature protein, and a long 3'-noncoding region encompassing 1564 bp. The predicted molecular weights of the preproprotein and the mature protein were calculated as 31.8 kDa and 25 kDa, respectively. The results of sequence analysis and alignment revealed a significant degree of sequence similarity with other eukaryotic cysteine proteases, including the conserved catalytic triad of the $Cys^{90},\;His^{226},\;and\;Asn^{250}$ residues which characterize the C1 family of papain-like cysteine protease. The nucleotide and amino acid sequences of the novel gene were deposited into the GenBank database under the accession numbers, AY390282 and AAR27011, respectively. The results of Northern blot analysis revealed the 2.5 kb size of the transcript and ubiquitous expression throughout the entirety of the body, head, gut, and skin, which suggested that the PLCP may be grouped within the cathepsin F-like proteases. The region encoding for the mature form of the protease was then subcloned into the pT7-7 expression vector following PCR amplification using the designed primers, including the initiation and termination codons. The recombinant cysteine proteases were generated in a range of 6.3 % to 12.5 % of the total cell proteins in the E. coli BL21(DE3) strain for 8 transformants. The results of SDS-PAGE and Western blot analysis indicated that a cysteine protease of approximately 25 kDa (mature form) was generated. The optimal pH and temperature of the enzyme were determined to be approximately 9.5 and $35^{\circ}C$, respectively, thereby indicating that the cysteine protease is a member of the alkaline protease group. The evaluation of substrate specificity indicated that the purified protease was more active towards Arg-X or Lys-X and did not efficiently cleave the substrates with non-polar amino acids at the P1 site. The PLCP evidenced fibrinolytic activity on the plasminogen-free fibrin plate test.

• Journal of Ginseng Research
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• 제44권3호
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• pp.461-474
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• 2020

Background: Ginseng effectively reduces fatigue in both animal models and clinical trials. However, the mechanism of action is not completely understood, and its molecular targets remain largely unknown. Methods: By screening for proteins that interact with the primary components of ginseng (ginsenosides) in an affinity chromatography assay, we have identified muscle-type creatine kinase (CK-MM) as a potential target in skeletal muscle tissues. Results: Biolayer interferometry analysis showed that ginsenoside metabolites, instead of parent ginsenosides, had direct interaction with recombinant human CK-MM. Subsequently, 20(S)-protopanaxadiol (PPD), which is a ginsenoside metabolite and displayed the strongest interaction with CK-MM in the study, was selected as a representative to confirm direct binding and its biological importance. Biolayer interferometry kinetics analysis and isothermal titration calorimetry assay demonstrated that PPD specifically bound to human CK-MM. Moreover, the mutation of key amino acids predicted by molecular docking decreased the affinity between PPD and CK-MM. The direct binding activated CK-MM activity in vitro and in vivo, which increased the levels of tissue phosphocreatine and strengthened the function of the creatine kinase/phosphocreatine system in skeletal muscle, thus buffering cellular ATP, delaying exercise-induced lactate accumulation, and improving exercise performance in mice. Conclusion: Our results suggest a cellular target and an initiating molecular event by which ginseng reduces fatigue. All these findings indicate PPD as a small molecular activator of CK-MM, which can help in further developing better CK-MM activators based on the dammarane-type triterpenoid structure.

• BMB Reports
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• 제51권11호
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• pp.572-577
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• 2018

Recent studies showed that the PD-1/PD-L1 checkpoint blockade is a dramatic therapy for melanoma by enhancing antitumor immune activity. Currently, major strategies for the PD-1/PD-L1 blockade have mainly focused on the use of antibodies and compounds. Seeking an alternative approach, others employ endogenous proteins as blocking agents. The extracellular domain of PD-1 (ePD1) includes the binding site with PD-L1. Accordingly, we constructed a PD-1-based recombinantly tailored fusion protein (dFv-ePD1) that consists of bivalent variable fragments (dFv) of an MMP-2/9-targeted antibody and ePD1. The melanoma-binding intensity and antitumor activity were also investigated. We found the intense and selective binding capability of the protein dFv-ePD1 to human melanoma specimens was confirmed by a tissue microarray. In addition, dFv-ePD1 significantly suppressed the migration and invasion of mouse melanoma B16-F1 cells, and displayed cytotoxicity to cancer cells in vitro. Notably, dFv-ePD1 significantly inhibited the growth of mouse melanoma B16-F1 tumor cells in mice and in vivo fluorescence imaging showed that dFv-ePD was gradually accumulated into the B16-F1 tumor. Also the B16-F1 tumor fluorescence intensity at the tumor site was stronger than that of dFv. This study indicates that the recombinant protein dFv-ePD1 has an intensive melanoma-binding capability and exerts potent therapeutic efficacy against melanoma. The novel format of the PD-L1-blocked agent may play an active role in antitumor immunotherapy.

• 생명과학회지
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• 제20권12호
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• pp.1743-1749
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• 2010

Edwardsiella tarda는 그람 음성의 장내세균과의 주요 어병세균으로 어류에 edwardsiellosis를 유발하는 전신감염성 병원체이다. 최근 병원성 세균의 외막 단백질들은 세균성 감염에 있어서 숙주와 반응하여 면역반응을 유도하는 것으로 여겨져 연구가 되고 있다. 일본의 연구팀은 어류에서 에드워드병의 원인체인 E. tarda의 37 kDa 단백질이 넙치에서 높은 항원성을 제시하는 것을 보고하였다. 또한 그 연구자들은 37 kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열이 GAPDH와 대응하는 것을 밝혔다. 본 연구에서는 다른 세균에서 알려진 N-말단 서열을 기반으로 primer를 제작하여 이에 상응하는 E. tarda DNA를 증폭하고 클로닝하였다. 이 DNA단편의 염기서열은 예상한 바와 같이 세균의 GAPDH유전자인 gapA와 높은 상동성이 있고, E. tarda GAPDH (etGAPDH)의 아미노산 서열은 다른 장내세균의 GAPDH와 70% 이상의 상동성을 보이는 것을 확인하였다. E. tarda의 외막단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 E. tarda의 GAPDH가 외막에 존재한다는 것을 증명하였고, gapA의 염기서열을 바탕으로하여 재조합 GAPDH를 과발현 시켰다. 과발현된 재조합단백질 GAPDH는 GAPDH 특이적인 항체를 제조하는데 사용되었고, 또한 넙치에 면역시켜 단일 단백질 백신으로서의 활용도를 모색하였다. 비록 재조합 GAPDH가 면역된 넙치에서 GAPDH에 특이적인 항체가 증가하였음에도 불구하고, E. tarda로 공격실험을 하였을 때 면역된 넙치의 생존율이 12.5%로 측정되어 면역된 그룹과 면역되지 않은 그룹간에 큰 차이가 없는 것이 확인되었다.

• 한국미생물학회:학술대회논문집
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• 한국미생물학회 2001년도 추계학술대회
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• pp.46-53
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• 2001

A commensal thermophile, Symbiobacterium toebii, isolated from hay compost (toebii) in Korea commensally interacted with a thermophilic Geobacillus toebii sp. nov., which was a new species within the genus Geobacillus on the basis of the phenotypic traits and molecular systematic data. S. toebii required the crude extracts and/or culture supernatant of the Geobacillus toebii for axenic growth and could grow on the temperature between 45 and $70^{\circ}C$ (optimum: $60^{\circ}C$; 2.4 h doubling time) and pH 6.0 and 9.0 (optimum: pH 7.5). The G+C content of the genomic DNA was $65 mol\%$, and the major quinones were MK-6 and MK-7. A phylogenetic analysis of its 16S rDNA sequence indicated that Symbiobacterium toebii was closely related with solely reported Symbiobacterium thermophilum. The presence of the commensal thermophile 16S rDNA and accumulation of indole in all the enriched cultures indicate that Symbiobacterium toebii is widely distributed in the various soils. The genome of S. toebii constituted a circular chromosome of 3,280,275 base pairs and there was not an extra-chromosomal element (ECE). It contained about 4,107 predicted coding sequences. Of these protein coding genes, about $45.6\%$ was encoded well-known proteins and annotated the functional assignment of 1,874 open reading frames (ORFs), and the rest predicted to have unknown functions. The genes encoding thermostable tyrosine phenol-lyase and tryptophan indole-lyase were cloned from the genomic DNA of S. toebii and the enzymatic production of L-tyrosine and L-tryptophan was carried out with two thermostable enzymes overexpressed in recombinant E. coli.

• 미생물학회지
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• 제28권2호
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• pp.91-97
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• 1990

생체내의 유해산소를 제거하는 superoxide dismutase (superoxide : superoxide oxidoreductase E.C.1.15.1.1) 중 세포질내에서 그 활성을 지니는 인체의 세포질 superoxide dismuta~ie (SODl) 유전자를 사람의 간 cDNA library로부터 동위원소로 표지된 oligonucleotide probe를 이용, in situ plaque hybridization 방법으로 선별 분리하여 내장균 벡터로 클로닝하였다. 이 클론은 SOD1 유전자의 5"L"TR과 3’UTR을 포함한 1.6 kb 정도의 cDNA였다 SOD1 구조유전자만을 선택적으로 분리하기 위해서 ATG를 포함하는 sense strand primer와 3’UTR 부위의 antisense strand primer를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction) 방법을 써서 SOD1 구조유전자 부위만을 선택적으로 증폭시켰다. Taq DNA polymerase에 의해 증폭된 DNA를 벡터 pUCl9의 multiple cloning site (MCS) 내의 Hinc II 위치에 넣였으며 이 insert DNA를 M13 mp19으로 옮겨 dideoxy chain termination 방법으로 sequenase를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 클론닝된 cDNA는 153개의 아미노산을 포함하고 있는 하나의 open reading frame (ORF)을 가셨다. 중합효소연쇄반응에 의해 이때 증폭된 SOD1 구조유전자를 $\lambda P_{L}$ 프로모터를 포함하고 있는 발현 벡터 pUPL에 옮긴 후 대장균에서 대량으로 발현시켰다. 이때 발현된 단백질 SOD1은 고유의 효소활성을 가지고 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제33권4호
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• pp.274-280
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• 2005

Pasteurella. multocida 균은 광범위한 질병을 야기시키는 악성 감염원으로 알려져 있다. 그람 음성균의 동종 및 이종간에 의한 감염에 대한 강력한 백신 후보 물질로써 OmpH라고 불리는 porin 단백질이 고려되어 왔다. 이 OmpH가 이번 연구에서 분리 및 정제되었다. 선도 단백질을 제거한 재조합 OmpH 단백질은 pRSET A발현벡터를 이용하여 40kDa로 발현되었으며, 친화성 크로마토그래피 정제되었다. OmpH에 대한 면역혈청을 얻기 위해, 한마리의 실험용 쥐에 한번에 50ug의 단백질을 복강 주사를 통해 2회에 걸쳐 주사했다. 항 OmpH 면역혈청의 증가는 ELISA로 측정되었다. 이번 실험에서 확인된 면역혈청의 증가는 OmpH단백질이 병원성 파스튜렐라 균이 일으키는 가금 콜레라를 예방하기 위한 백신의 강력한 후보임을 보여주고 있다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권4호
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• pp.299-306
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• 2008

사람 췌장 리파아제는 췌장에서 합성되어 소장으로 분비된 후, 음식물속의 지방을 가수분해하는 소화효소이다. 췌장 리파아제 단백질은 촉매활성도메인과 코리파아제 결합도메인의 2개의 도메인으로 구성되어 있다 본 연구에서는 리파아제 전체단백질과 촉매활성도메인 및 코리파아제 결함도메인 유전자를 PCR 방법으로 증폭하여 발현벡터에 넣은 후, 대장균에서 발현시켜 얻은 3가지 재조합 단백질을 산란계에 3차례 주사하여 면역반응을 유도하였다. 난황단백질을 분리하여 항체가를 측정한 결과, 코리파아제 결합도메인의 항원성이 가장 높은 것으로 밝혀졌다. 또한, 돼지 췌장 리파아제의 활성저해 실험에서도 코리파아제 결합도메인에 의해 만들어진 난황항체가 지방분해활성 저해작용이 가장 큰 것으로 밝혀졌다. 코리파아제 결합도메인 난황항체가 첨가된 지방을 실험동물에게 급여하고 혈중 주요 성분을 분석한 결과, 코리파아제 결합도메인에 의한 난황항체를 섭취한 경우에 혈중 중성지방의 수치가 대조군에 비해서 유의적으로 감소했음을 화인하였다. 결론적으로 코리파아제 결합도메인을 항원단백질로 사용하여 얻은 난황항체가 생체 내에서 췌장 리파아제의 활성을 억제할 수 있으며 비만억제제로의 개발 가능성이 있음을 보여주었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권1호
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• pp.123-129
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• 2007

The trehalose $({\alpha}-D-glucopyranosyl-[1,1]-{\alpha}-D-glucopyranose)$ biosynthesis genes MhMTS and MhMTH, encoding a maltooligosyltrehalose synthase (MhMTS) and a maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (MhMTH), respectively, have been cloned from the hyperthermophilic archaebacterium Metallosphaera hakonesis. The ORF of MhMTS is 2,142 bp long, and encodes 713 amino acid residues constituting a 83.8 kDa protein. MhMTH is 1,677 bp long, and encodes 558 amino acid residues constituting a 63.7 kDa protein. The deduced amino acid sequences of MhMTS and MhMTH contain four regions highly conserved for MTSs and three for MTHs that are known to constitute substrate-binding sites of starch-hydrolyzing enzymes. Recombinant proteins obtained by expressing the MhMTS and MhMTH genes in E. coli catalyzed a sequential reaction converting maltooligosaccharides to produce trehalose. Optimum pH of the MhMTS/MhMTH enzyme reaction was around 5.0 and optimum temperature was around 70 C. Trehalose-producing activity of the MhMTS/ MhMTH was notably stable, retaining 80% of the activity after preincubation of the enzyme mixture at $70^{\circ}C$ for 48 h, but was gradually abolished by incubating at above $85^{\circ}C$. Addition of thermostable $4-{\alpha}-glucanotransferase$ increased the yield of trehalose production from maltopentaose by 10%. The substrate specificity of the MhMTS/MhMTH-catalyzed reaction was extended to soluble starch, the most abundant maltodextrin in nature.