• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.97-97
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• 2002

Human eryhropoietin (EPO) is acidic glycoprotein hormone that plays key role in hematopoiesis by facilitating differentiation of erythrocyte and formation of hemoglobin (Hb) and is used for the treatment of anemia. Human EPO is consist of 166 amino acids which is modified by three N-glycosylations (24, 38, 83) and single O-glycosylation (126). N-glycosylation is reported to be related to the cellular secretion and activity of EPO. In this study, we examined effects of mutagenesis in glycosylation site of recombinat hEPO for the cellular secretion during production from cultured CHO cell. We produced rhEpo which was cloned by PCR from human liver cDNA (TaKaRa) in cultured CHO cell. Using supernatant of the culture, ELISA assay and western analysis were performed. To estimate biological activity, 20IU of rhuEpo was subcutaneously injected into four ICR mice. After 8 days, HCT level was increased average 13 per cent, RBC was increased ca. 2${\times}$10$\^$6//${\mu}\ell$. In disease model Rat (anemia c-kit, WSRC-WS/WS), HCT was increased ca. 12%, RBC was increased ca. 1.6${\times}$10$\^$6//${\mu}\ell$. These results suggests that rhEpo we produced has biological activity. To remove glycosylation site by substituting 24, 38, 83, and 126th asparagine (or serine) with glutamic acid, overlapping -extension site-directed mutagenesis was performed. To add novel glycosylation sites, 69, 105th leucine was mutated to asparagine. Mutant EPO construct was transfected into CHO cell. Supernatant of the cell culture was analyzed using ELISA assay with monoclonal anti-EPO antibody (Medac, Germany). Since, several reports for mutagenesis of glycosylation sites showed case-by-case results, we examined both transient expression and stable expression. Addition of novel glycosylation sites resulted no secretion while deletion mutants had little effect except some double deletion mutants (24/83 and 38/83) and triple mutant. We suggest that not single but combination of glycosyl group affect secretion of EPO.

• 대한미생물학회지
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• 제35권3호
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• pp.263-271
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• 2000

A clinical isolate of Klebsiella pneumoniae K7746 produced the extended-spectrum ${\beta}$-lactamase (ESBL) SHV-12. A 6.6 kb BamHI fragment containing the $bla_{SHV-12}$ gene of K7746 strain was cloned into pCRScriptCAM vector resulting in the recombinant plasmid p7746-Cl. The restriction map of 3.6 kb inserted DNA and sequences immediately surrounding $bla_{SHV-12}$ of p7746-C1 were homologous to plasmid pMPA2a carrying $bla_{SHV-2a}$. In addition, both $bla_{SHV-12}$ and $bla_{SHV-2a}$ were expressed from a common hybrid promoter made of the -35 region derived from the left inverted repeat of IS26 and the -10 region from the $bla_{SHV}$ promoter itself. The results indicate that $bla_{SHV-12}$ and $bla_{SHV-2a}$ may have evolved from a common ancestor in the sequential order of $bla_{SHV-2a}$ first, followed by $bla_{SHV-12}$. Furthermore, by the PCR mapping method using primers corresponding to the IS26 and $bla_{SHV}$, the association between IS26 and $bla_{SHV}$ was studied in 12 clinical isolates carrying $bla_{SHV-2a}$, 27 clinical isolates carrying $bla_{SHV-12}$, and 5 reference strains carrying $bla_{SHV-1}$ to $bla_{SHV-5}$. All 39 strains carrying $bla_{SHV-2a}$ or $bla_{SHV-12}$ were positive by the PCR, providing confirmative evidence that IS26 has been involved in the evolution and dissemination of $bla_{SHV-2a}$ and $bla_{SHV-12}$. But 5 reference strains carrying $bla_{SHV-1}$ to $bla_{SHV-5}$ were negative by the PCR. Therefore, we concluded that the molecular evolutionary pathway of $bla_{SHV-2a}$ and $bla_{SHV-12}$ may be different from that of other $bla_{SHV-ESBL}$, e.g., $bla_{SHV-2}$, $bla_{SHV-3}$, $bla_{SHV-4}$, and $bla_{SHV-5}$.

• BMB Reports
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• 제35권3호
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• pp.330-336
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• 2002

The lgtB genes that encode $\beta$-1,4-galactosyltransferases from Neisseria meningitidis ATCC 13102 and gonorrhoeae ATCC 31151 were isolated by a polymerase chain reaction using the pfu DNA polymerase. They were expressed under the control of lac and T7 promoters in Escherichia coli M15 and BL21 (DE3). Although the genes were efficiently expressed in E. coli M15 at $37^{\circ}C$ (33 kDa), most of the $\beta$-1,4-galactosyltransferases that were produced were insoluble and proteolysed into enzymatically inactive polypeptides that lacked C-terminal residues (29.5 kDa and 28 kDa) during the purification steps. When the temperature of the cell growth was lowered to $25^{\circ}C$, however, the solubility of the $\beta$-1,4-galactosyltransferases increased substantially. A stable N-terminal his-tagged recombinant enzyme preparation could be achieved with E. coli BL21 (DE3) that expressed lgtB. Therefore, the cloned $\beta$-1,4-galactosyltransferases were expressed under the control of the T7 promoter in E. coli BL21 (DE3), mostly to the soluble form at $25^{\circ}C$. The proteins were easily purified to homogeneity by column chromatography using Ni-NTA resin, and were found to be active. The galactosyltransferases exhibited pH optimum at 6.5-7.0, and had an essential requirement for the $Mn^{+2}$ ions for its action. The $Mg^{+2}$ and $Ca{+2}$ ions showed about half of the galactosyltransferase activities with the $Mn^{+2}$ ion. In the presence of the $Fe^{+2}$ ion, partial activation was observed with the $\beta$-1,4-galactosyltransferase from N. meningitidis(64% of the enzyme activity with the $Mn^{+2}$$Ni^{+2}$, $Zn^{+2}$, and $Cu^{+2}$ ions could not activate the $\beta$-1,4-galactosyltransferase activity. The inhibited enzyme activity with the $Ni^{+2}$ ion was partially recovered with the $Mn^{+2}$$Fe^{+2}$, $Zn^{+2}$, and $Cu^{+2}$ ions, the $Mn^{+2}$$\beta$-1,4-galactosyltransferase activity was 1.5-fold stimulated with the non-ionic detergent Triton X-100 (0.1-5%).

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제16권6호
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• pp.468-475
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• 1988

고초균 (Bacillus subtilis)의 cytidine/2'deoxycytidine deaminase (EC 3.5.4.5)를 로드하는 cdd 유전자를 cdd 결손변이주 B. subtilis ED4O에서 발현시켰다. 이 cdd 유전자는 Bacillus의 λD69 유전자은행으로부터 처음 클로닝된 것으로서 B. subtilis-Escherichia coli 의 shuttle vector pGB 215-110ΔB의 EcoRl/Pvul 부위에 삽입시켰다. 형질전환된 ED4O는 야생주에 비해 3700unit의 강한 cdd 활성을 나타내었으며 이 클론된 백터 pSO100 을 E. coli에서 발현시키면 B. subtilis 비해 2배의 강한 활성을 나타내었다. 겔 여과로 부분정제한 본 효소의 Km치는 1.88$\times$$10^{-4}$M이었으며 Vmax=11.1 $\mu$mol/min/mg 단백이었다. 이 효소는 0.1M mercaptoethanol과 수은에 의해 완전저해되었으며 p-chloromercurybenzoic acid에 대해 Ki=5$\mu$M로 나타났다. 본 효소의 활성상실은 monomer에 함유된 6개의 cysteine 잔기의 일부가 활성단으로 작용하는 과정이 저해되었거나 tetramer로서의 회합과정이 저해되었기 때문인 것으로 추측되었다.

• 미생물학회지
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• 제45권2호
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• pp.228-231
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• 2009

고추 역병을 야기하는 Phytophthora capsici 는 짧은 시간 내에 많은 면적에 피해를 주는 병으로 한번 발생하면 방제가 어려운 병으로 알려져 있다. 이러한 역병 곰팡이의 방제를 위하여 본 연구에서는 P. capsici의 염색체 복제 및 세포 골격 유지 등에 관여하는 단백질인 microtubule의 형성 저해를 유도하는 물질을 탐색하여 궁극적으로 고추역병 방제를 위한 연구를 진행하였다. 먼저 P. capsici alpha 및 beta tubulin을 E. coli BL21(DE3)에서 발현시켜 분리 정제하여 in vitro microtubule 형성을 확인하였다. P. capsici microtubule 형성 저해 metagenome clone 스크리닝을 위하여 경기도 수원의 여기산 토양에서 metagenome을 분리하여 library를 제작하여 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 방법을 이용하여 P. capsici microtubule 형성을 저해하는 화합물을 탐색하였다. In vitro 스크리닝에서 약 384개의 metagenome library에서 2종의 clone을 선택하여 고추작물에 직접 방제하여 역병균의 생장 억제를 확인하였다. 이는 차후 고추역병 방제제 개발에 있어 중요한 후보물질뿐만 아니라 metagenome library를 이용한 새로운 방법의 개발이라 사료 된다. 또한 in vitro 스크리닝에서 얻어진 2종의 metagenome clone의 염기서열을 분석하여 항역병 활성에 관련하는 DNA 서열을 확보하고 이를 응용하여 물질을 생산 할 경우, 현장에서 활용 할 수 있는 효과 큰 친환경 천연고추역병 방제제로서의 개발 가능성을 가진다는 점에서 본 연구결과는 매우 의미 있는 결과라 생각된다.

• 미생물학회지
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• 제44권1호
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• pp.74-79
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• 2008

L-ascorbic acid (AA)의 2번 위치의 수산기에 부위 특이적 활성을 갖는 Paenibacillus sp. JB-13 유래의 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) 유전자(cgt gene)를 pEXP7 발현 vector에 클로닝하여 재조합 균주를 구축하였다. 재조합 균주의 CGTase생산 최적 조건을 검토하여 본 결과 LB 배지에 0.5% glucose, 3.0% polypeptone, 0.3% $K_2HPO_4$, 0.5% NaCl이 되도록 추가하고, 초기 pH 7.0, 접종량 2%, 통기량 0.1 vvm, 배양 온도 $37^{\circ}C$, 배양 시간 14시간의 조건에서 최대 활성을 나타내었다. 재조합 균주와 기존 균주의 CGTase 활성을 비교한 결과 재조합 균주는 배양 14시간째 640 units/ml의 활성을 가져 기존 균주에 비해 70%의 활성을 나타내지만 배양 시간을 1/4로 단축시킬 수 있다는 이점이 있음을 확인하였다. 재조합 균주가 생산한 CGTase를AA-2G합성에 적용하여 AA-2G를 합성하고 HPLC로 분석한 결과 단일 peak를 확인할 수 있었고 ${\alpha}$-glucosidase를 처리하여 확인한 결과 AA와 glucose로 분리됨을 확인할 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제27권11호
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• pp.1971-1982
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• 2017

Piliated Lactobacillus rhamnosus (pLR) strains possess higher adherent capacity than non-piliated strains. The objective of this study was to isolate and characterize probiotic pLR strains in human fecal samples. To this end, mouse polyclonal antiserum (anti-SpaA) against the recombinant pilus protein (SpaA) of L. rhamnosus strain GG (LGG) was prepared and tested for its reactivity and specificity. With the anti-SpaA, a method combining the de Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) agar plating separation and colony immunoblotting (CIB) was developed to isolate pLR from 124 human fecal samples. The genetic and phenotypic characteristics of the resultant pLR isolates were compared by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprinting, and examination of adhesion to Caco-2 cells, hydrophobicity, autoaggregation, and in vitro gastrointestinal tolerance. Anti-SpaA specifically reacted with three pLR strains of 25 test strains, as assessed by western blotting, immunofluorescence flow cytometry, and immunoelectron microscopy (IEM) assays. The optimized MRS agar separation plus anti-SpaA-based CIB procedure could quantitatively detect $2.5{\times}10^3CFU/ml$ of pLR colonies spiked in $10^6CFU/ml$ of background bacteria. Eight pLR strains were identified in 124 human fecal samples, and were confirmed by 16S RNA gene sequencing and IEM identification. RAPD fingerprinting of the pLR strains revealed seven different patterns, of which only two isolates from infants showed the same RAPD profiles with LGG. Strain PLR06 was obtained with high adhesion and autoaggregation activities, hydrophobicity, and gastrointestinal tolerance. Anti-SpaA-based CIB is a rapid and inexpensive method for the preliminary screening of novel adherent L. rhamnosus strains for commercial purposes.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제29권4호
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• pp.287-293
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• 2002

병독성 대장균 (K88ac)의 pilin gene을 분리하여 이를 당근에 도입한 후 이의 발현을 유도하여 자돈 설사병 예방 및 치료를 위한 당근경구백신 개발을 목적으로 하였다. 형질전환을 통해 494 세포주를 확립하였고, western분석을 통하여 0.1~4 $\mu\textrm{g}$/g의 pilin 단백질 발현을 확인하였으며 백신식물 생산에 적합한 세포주 2종 (M1-17, Y14-1)을 선발하여 포장생산 및 임상실험에 적용하였다. 쥐를 대상으로 당근 경구 투여시 병원균 항체 생성 여부와 면역 유도를 위한 최적 농도 지표를 파악하기 위하여 1주 간격으로 형질전환 당근 1g, 3g, 5g을 경구투여 한 결과 백신 당근 3g 투여시 10$\mu\textrm{g}$의 재조합 pilin 백신을 경구 투여한 것에 비해 다소 높은 항체 생성을 나타냈으며 3g의 분량이 쥐 면역 유도를 위한 적정량으로 확인하였다. 자돈에 대한 백신당근 경구 투여시 자돈 설사병 보호 효과를 정량적으로 구명하기 위하여 분석한 자돈의 일당 증체량은 형질전환 당근 투여시 평균 60g 이상 더 높은 증체량을 보였으며, 질병방제 효과를 구명하기 위하여 장독성 병원균을 인위 접종한 결과 대조구에서만 fecal score 3의 심각한 설사를 확인하였다. 본 연구를 통해 개발된 당근백신은 효율적 투여방법 등에 대한 후속 실험을 통하여 산업적 이용 가능성이 탐색될 예정이다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제38권2호
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• pp.125-129
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• 2011

GM작물의 상용화를 위하여서는 반드시 환경위해성평가를 거쳐야 한다. 불행하게도 초기 event가 개발되고 기본적인 검토가 완료된 GM작물에 대하여 환경위해성평가를 수행하기 위하여서는 약 7백만에서 1,500만불의 경비가 소요되며 기간 또한 수년이 필요하다. 따라서 저자는 사용화를 위한 GM작물의 개발을 위한 프로젝트에 관여하는 개발자는 실험실 또는 온실단계의 아주 초기단계에서부터 환경위해성평가기준을 충분히 숙지하여야 한다고 제안한다. 기존의 많은 리뷰논몬에서 이미 지적된 것 과 같이 GM작물의 상용화과제에서 가장 큰 걸림돌(죽음의 계곡)은 초기 사상 (event)의 선발과정이며, 대부분이 이 단계에서 충분한 자료를 제시할 수 없어서 포기한다는 사실을 간과하여서는 안 될 것이다. 특히 지극히 기본적인 분자생물학 특성에 관한 자료들로서 예를 들어 도입유전자의 copy 수, 숙주의 게놈내 도입위치, 도입유전자의 주변 염기서열, 유전자 재배열과 도입유전자로 인한 숙주 내 기존유전자의 knock out 현상의 여부 등에 관한 충분한 자료를 제시하지 못하는 경우가 많으며 이는 GM 작물의 개발 초기단계에서부터 철저하게 검증이 이루어져야 하는 항목들이다. 국내의 경우, 농촌진흥청은 2011년부터 2020년까지 10년간 "차세대바이오그린 21 사업"을 발족하여 추진 중에 있으며 특히 국내용뿐만 아니라 중국의 사막화 지역 등 불량환경에 재배가 가능한 GM작물 등 해외로 수출을 위한 global GM작물의 개발을 위한 전략을 수립하여 추진 중에 있다. 따라서 저자는 환경위해성평가기준에 부합되는 초기 event의 선발 과정에 역점을 두어 사전에 분자생물학적 특성에 관한 RA기준을 고려하여 자체평가시스템을 도입하도록 제안 한다.

• 생명과학회지
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• 제26권10호
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• pp.1113-1120
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• 2016

우리나라의 전통 발효 된장으로부터 균체외 효소로 mannanase를 생산하는 세균 2주가 분리되었다. 분리균 WL-6과 WL-11은 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rDNA의 염기서열에 따라 Bacillus subtilis로 확인되었다. 이들 두 균주로부터 각각 mannanase 유전자를 대장균에 클로닝하여 염기서열을 결정한 결과 mannanase 유전자는 362 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,086 뉴클레오티드로 동일하게 이루어졌다. WL-6과 WL-11 mannanase (Man6, Man11)의 아미노산 잔기 배열은 서로 8개 잔기가 다르며 GH family 26에 속하는 B. subtilis의 mannanases와 매우 상동성이 높았다. Man6과 Man11의 아미노 말단의 26개 아미노 잔기가 signal peptide로 예측되었다. 재조합 대장균로부터 각각 생산된 Man6과 Man11은 94~95% 정도가 균체내에 존재하였고, mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, mannohexaose와 같은 만노올리고당과 locust bean gum을 유사하게 분해하여 주된 반응산물로 mannobiose와 mannotriose를 생성하였다. Man6는 55℃와 pH 6.0, Man11은 60℃와 pH 5.5에서 각각 최대 반응활성을 보였으며, Man11이 Man6에 비해 열안정성이 높았다.