• BMB Reports
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• 제43권2호
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• pp.110-114
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• 2010

The yeast three-hybrid system (Y3H), a powerful method for identifying RNA-binding proteins, still suffers from many false positives, due mostly to RNA-independent interactions. In this study, we attempted to efficiently identify false positives by introducing a tetracycline operator (tetO) motif into the RPR1 promoter of an RNA hybrid expression vector. We successfully developed a tight tetracycline-regulatable RPR1 promoter variant containing a single tetO motif between the transcription start site and the A-box sequence of the RPR1 promoter. Expression from this tetracycline-regulatable RPR1 promoter in the presence of tetracycline-response transcription activator (tTA) was positively controlled by doxycycline (Dox), a derivative of tetracycline. This on-off control runs opposite to the general knowledge that Dox negatively regulates tTA. This positively controlled RPR1 promoter system can therefore efficiently eliminate RNA-independent false positives commonly observed in the Y3H system by directly monitoring RNA hybrid expression.

• 미생물학회지
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• 제30권6호
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• pp.466-471
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• 1992

HTLV-I 의 gag-pro 유전자 중첩영역내에서 -1 ribosomal frameshifting 이 일어나는 자리를 결정하기 위하여 gag-pro 중첩영역의 일부를 SP6 promoter 를 가진 백터내에 클로닝하였다. 그 결과 닭의 prelysozyme 에서 유래한 5개의 아미노산을 코드하는 합성유전자와 141 bp 로된 gag-pro 중첩영역의 뒤에 Straphylococcus aureus 의 protein A 유전자단편이 연결된 hybrid 유전자를 보유한 플라스미드를 제작하였다. 이 DNA 클론을 주형으로 SP6 RNA polymerase 의 작용에 의해 한종류의 mRNA 를 다량으로 합성하였다. Invitro 에서 합성된 mRNA 로 무세포계에서 단백질을 합성한 결과 21 kDal 의 단백질이 생성되었고 IgG-Sepharose 를 사용한 affinity chromatography 로 합성된 단백질을 순수하게 정제할 수 있었다. 본연구에서 설명한 in vitro 실험계는 Gag-Pro transframe 단백질의 신속한 정제 및 일차구조의 결정에 유익하게 사용될 것으로 보이며 이와 같은 실험의 결과 mRNA 에서 ribosomal frameshifting 이 일어나는 정확한 site 를 결정할 수 있을 뿐 같은 실험의 결과 mRNA 에서 ribosomal frameshifting 이 일어나는 정확한 site 를 결정할 수 있을 뿐 아니가 pro 유전자의 발현에 필요한 frameshift 를 유도하는 tRNA 의 동정도 가능하게 될 것이다.

• The Plant Pathology Journal
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• 제31권2호
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• pp.108-114
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• 2015

Curvularia lunata is an important maize foliar fungal pathogen that distributes widely in maize growing area in China, and several key pathogenic factors have been isolated. An yeast two-hybrid (Y2H) library is a very useful platform to further unravel novel pathogenic factors in C. lunata. To construct a high-quality full length-expression cDNA library from the C. lunata for application to pathogenesis-related protein-protein interaction screening, total RNA was extracted. The SMART (Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript) technique was used for cDNA synthesis. Double-stranded cDNA was ligated into the pGADT7-Rec vector with Herring Testes Carrier DNA using homologous recombination method. The ligation mixture was transformed into competent yeast AH109 cells to construct the primary cDNA library. Eventually, a high qualitative library was successfully established according to an evaluation on quality. The transformation efficiency was about $6.39{\times}10^5$ transformants/$3{\mu}g$ pGADT7-Rec. The titer of the primary cDNA library was $2.5{\times}10^8cfu/mL$. The numbers for the cDNA library was $2.46{\times}10^5$. Randomly picked clones show that the recombination rate was 88.24%. Gel electrophoresis results indicated that the fragments ranged from 0.4 kb to 3.0 kb. Melanin synthesis protein Brn1 (1,3,8-hydroxynaphthalene reductase) was used as a "bait" to test the sufficiency of the Y2H library. As a result, a cDNA clone encoding VelB protein that was known to be involved in the regulation of diverse cellular processes, including control of secondary metabolism containing melanin and toxin production in many filamentous fungi was identified. Further study on the exact role of the VelB gene is underway.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권4호
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• pp.371-378
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• 1997

본 연구는 인체 락토페린(hLF)을 우유 중으로 생산하는 형질전환 젖소의 개발에 관한 것이다. 이를 위한 모델 시스템으로서 락토페린 cDNAdhk 소의 베타-카제인 프로모터를 이용하여 형질전환 생쥐를 개발하였다. 발현 벡터의 락토페린에 대한 발현효율을 증가시키기 위하여 2개의 재조합 인트론을 삽입하였다. 20계통의 형질전환 생지를 개발하였는데 유즙에서의 락토페린 발현량은 1~200$\mu\textrm{g}$/ml이었다. hLF RNA의 발현 양상을 유선조직을 포함하여 뇌, 신장, 간 조직 등에서 조사하였을 때, 오직 유선에서만 발현되었을 뿐 아니라 엑손/인트론 경계 부위에서 정확하게 splicing되었다. hLF를 생산하는 형질전환 젖소를 개발하기 위하여 위에서 기술한 DNA를 소의 수정란에 미세주입한 후, 외과적 또는 비외과적 방법으로 대리모에 이식하였다. 한편, DNA가 주입된 수정란의 상태가 임신율에 미치는 영향을 조사하였다. 수정란을 최우수, 우수, 보통 등 3등급으로 나누었을 때, 각각의 임신율은 38.9, 15.4, 14.3%로 나타났다. 현재까지 유전자가 주입된 수정란을 대리모에 이식하여 태어난 35마리의 송아지 중, 30마리는 형절전환되지 않았으며 나머지는 현재 분석 중에 있다. 이상의 결과로 본 연구자들은 DNA가 미세주입된 젖소 수정란의 배양과 이식에 필요한 제반 기술을 확립하였으며, 아울러 임신율에 영향을 주는 여러 인자들에 대한 연구도 함께 조사하였다.

• 대한생식의학회:학술대회논문집
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• 대한불임학회 2001년도 제2차 연수강좌
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• pp.195-205
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• 2001

태반 영양배엽 (trophoblast)은 포유동물의 발생과정 중 가장 먼저 분화되는 세포로서, 자궁환경내에서 배아가 착상, 발생, 및 분화하기 위해서 반드시 필요한 태반을 형성하는 색심적인 세포이다. 영양배엽 세포의 분화과정중의 결함은 배아의 사산이나 임신질환 등의 치명적 결과를 초래한다. 하지만, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 분자생물학적인 메카니즘은 아직 규명되지 않고 있다. 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 경로를 규경하기 위한 선결과제는 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 많은 유전자들이 밝혀져야만 한다. 본 연구팀은 최근에 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 두 종류의 새로운 유전자들을 찾았다. 한 종류는 homeobox를 보유하고 있는 조절 유전자 Psx이고, 다른 한 종류는 임신호르몬인 태반 프로락틴 라이크 단백질 유전자 PLP-C${\beta}$이다. 본 연구과제의 목표는 이들 유전자의 기능과 조절 메카니즘을 규명함으로써, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 조절경로를 밝히는 것이다. 이를 위하여 다음과 같은 일련의 연구를 수행할 것이다. 1) Psx 유전자가 분화된 영양배엽 세포에서만 발현케 하는 조절 메카니즘을 규명하기 위해 functional assays, in vitro footprinting, gel mobility shift assays, 생쥐형질전화, UV crosslinking, Southwestern blot 등의 방법을 통해 Psx 유전자의 cis-acting 요인과 trans-acting factor를 밝혀 분석한다. 2) 영양배엽 세포의 분화조절 경로를 규명하기 위해 random oligonuclotide library screening, DD-PCR, subtractive screening 등의 방법을 이용하여 Psx 유전자에 의해 조절되는 하부유전자를 밝힌다. 3) Psx 유전자를 knock-out시켜 영양배엽 세포가 발달 및 분화하는데 미치는 역할을 밝힌다. 4) Yeast two-hybrid screening방법을 이용하여 태반 프로락틴 유전자의 수용체를 찾아 이들의 신호전달 기전을 밝힌다. 제1차년 연구결과로서, mouse와 rat으로부터 각각 Psx 유전자의 genomic DNA를 클로닝하여, 유전자 구조를 비교한 결과, mouse Psx (mPsx2)는 4개의 exons으로 이루어져 있는 반면에, rat Psx (Psx3)는 3개의 exons으로 구성되어 있었다. 즉, rPsx3는 mPsx2의 exon1이 없었다. Notrhern blot과 in situ hybridization 분석에 의해 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 발현 조절되는 현상을 밝혔다. 실제로 mPsx2와 rPsx3의 5'-flanking지역을 클로닝하여 염기서열 분석 결과 전혀 homology를 찾을 수 없었다. 또한, 이들 각각 promoter의 activity를 luciferase reporter를 이용하여 조사한 결과 Rcho-1 trophoblast cells에서 각기 다른 activity를 보여 주는 것을 발견하였다. Psx 유전자의 transcription start sites는 Primer extension에 의해 밝혔다. 또한 Psx2 유전자를 knock-out 시키기 위해 targeting vector를 Osdupde1에 제작하였다. 본 과제를 시작할 때 새로운 프로락틴 유전자 하나를 클로닝하여 이 유전자를 PLP-I라고 이름을 붙였다. 이 후 이 유전자 (PLP-I)는 PLP-C${\beta}$라고 이름을 붙이게 되었다. Mouse PLP-C${\beta}$ 유전자의 counterpart를 rat에서 찾아 염기서열을 비교한 결과 mouse와 rat에서 PLP-C${\beta}$유전자의 homology는 약 79% (amino acid level)였다. 본 연구과정을 통해 또 하나의 새로운 PLP-C subfamily member를 mouse로부터 클로닝 하였고, 이 유전자를 PLP-C${\gamma}$라 하였다. PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$의 발현 유형은 Northern blot과 in 냐셔 hybridization 분석에 의해 태반의 제한된 spongitrophoblast와 trophoblast giant cells에서만 발현하는 것을 밝혔다. 놀랍게도 이들 두 새로운 유전자는 alternative splicing에 의해 두 종류의 isoform이 있음을 밝혔다. PLP family member 유전자로서 splicing에 의한 isoforms을 보여 주는 유전자로는 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 최초이다. 이들 isoform mRNAs의 발현 유형은 RT-PCR 방법을 이용하여 규명하였다. 또 하나의 새로운 발견은 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 독특한 유전자 구조를 갖고 있었다. 즉, PLP-C${\beta}$는 exon3의 alternative splicing에 의해 5개 혹은 6개의 exons을 갖는 two isoforms이 생긴다. 반면에 PLP-C${\gamma}$는 exon2가 alternative splcing이 되면서 7개의 exons을 갖거나 6개의 exons을 갖는 isoforms을 만든다. 그리고, PLP-C${\gamma}$의 promoter activity를 trophoblast Rcho-l${\gamma}$ 세포주를 이용하여 PLP-C${\gamma}$ 의 1.5 kb 5'-flanking 지역이 trophoblast-specific promoter activity를 갖고 있음을 밝혔다. PLP-C${\gamma}$ 유전자의 transcription start site는 Primer extension에 의해 밝혔다. 제 1차 년도의 연구결과를 토대로, 2차년에서는 다음단계의 연구를 수행하고자 한다. 즉, 1) mPsx2와 rPsx3의 promoter를 비교분석 함으로서 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 조절되는 메카니즘 규명, 2) Psx와 PLP-C 유전자의 promoter에 있는 cis-acting elements 탐색, 3) Psx2와 Psx3의 단백질을 이용하여 이들이 binding하는 target sequence 규명, 4) 제작한 Psx2 targeting vector를 이용하여 ES cells에서 Psx2 유전자 knock-out, 5) Psx 유전자를 과발현시키는 세포주를 만들고 Psx에 의해 조절되는 유전자 탐색, 6) 새로 밝히 PLP-C members 유전자들의 조절기전을 Rcho-1 세포주를 이용하여 여러 거지 성장인자와 다른 호르몬에 대한 반응을 탐색, 7) Psx와 PLP-C${\gamma}$ 유전자의 chromosomal mapping 등을 밝힐 것이다.