느타리버섯에 발생하여 갈색부패병을 일으키는 P. tolaasii 및 P.agarici 를 면역화학적 방법으로 신속하게 검출하기 위한 항체를 생산하였고 면역확산법과 ELISA 로 본 항체의 특이성을 조사하였다. $\alpha$-P tolaasii 항체는 P. tolaasii와 반응하여 선명한 침강선을 형성하지 않아 P. tolaasii 에 대하여만 특이적으로 반응하는 항체임을 알 수 있었다. 한편 $\alpha$-P. agarici 항체는 P.agarici뿐만 아니라 다른 세균에 대해서도 침강선을 형성하지 않는 특징을 나타내었다. 비경합 간접 ELISA의 표준곡선으로부터 P.agarici의 검출에 대하여 최고 발색치의 50% 갑을 나타내는 균의 밀도는 $2{\times}10^4$ cfu/ml로 나타났으며, 검출한계농도는 $2{\times}10^3$ cfu/ml 이었다.${\alpha}$-P. agarici 항체는 P. tolaasii의 특이적인 검출에도 효과를 나타냈다. ${\alpha}$-P. tolaasii, ${\alpha}$-P. agarici 항체를 이용하여 확립한 ELISA법은 직접 균체나 버섯 자실체내 P. tolaasii 와 P. agarici의 신속한 검출을 가능하게 하였고, P. tolaasii 와 P. agarici에 오염된 시료를 간단하게 진단하는데 아주 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단되었다.
본 연구는 느타리버섯 갈반병 병원균인 pseudomonas tolaasii의 진단을 위한 분자 marker를 개발하기 위해 수행되었다. 세균의 반복염기서열과 펙틴 분해효소 유전자로부터 제작된 여러개의 primer들을 이용해 식용버섯으로부터 분리된 Pseudomonas종들로부터 DNA 다형성을 유도한 바펙틴 분해 효소로부터 제작된 PEU1 primer는 다른 Pseudomonas종들로부터 P. tolaasii를 구분시키는 다형성 밴드를 생성하였다. P. tolaasii 6균주에 공통적으로 나타나는 1.0kb와 0.4kb의 두 가지 밴드를 pGEM-T에 클로닝하고 이들을 각기 pPTOP1과 pPTOP2로 명명하고 probe로 이용하였다. 0.4kb 크기의 pPTOP2의 삽입 DNA는 P. tolaasii 6균주와 hybridization이 이루어진 반면 다른 Pseudomonas종과는 반응하지 않았다. 0.4kb크기의 pPTOP2의 삽입 DNA를 probe로 이용해 dot blot hybridization한 결과 P. tolaasii는 $1.5{\times}10^3\;cfu$까지 검출이 가능함을 확인하였다.
Pseudomonas tolaasii와 WLRO(White line reacting organism)의 국내 수집 균주들에 대하여 REP, ERIC, BOX-PCR분석을 이용하여 유전적 다양성을 측정하였다. p. tolaasii 균주들은 매우 유사하였으나 WLRO 균주들을 상호간의 큰 차이를 보였다. 유전적 근연관계 분석 결과 WLRO 균주들은 유전적으로 변이가 높은 복합 집단 양상을 나타내었다. p. tolaasii 균주들과 WLRO 균주들 사이의 repetitive DNA 부위의 유전적 근연 관계는 적은 것으로 나타났다.
A DNA fragment which is involved in tolassin production was cloned to obtain a molecular marker of Pseudomonas tolaasii, a casual agent of bacterial brown blotch disease of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus). Tolaasin is a lipodepsipeptide toxin and known as a primary disease determinant of the P. tolaasii. It is responsible for formation of white line in agar when P. tolaasii were cultured against white line reacting organisms (WLROs). White line negative mutants (WL-) were generated by conjugation between rifampicin resistant strain of P. tolaasii and E. coli carrying suicidal plasmid pSUP2021 : : Tn5. The ability of tolaasin production of the WL- mutants was examined by hemolysis test, pathogenicity test, and high pressure liquid chromatography (HPLC) analysis of culture filtrate. All of the WL- mutants were lost the ability of tolaasin production (Tol-). Genomic library of the Tol- mutant was constructed in pLAFR3 and the cosmid clone containing Tn5 was selected. DNA fragment fro franking region of Tn5 was cloned from the plasmid and used as a probe in Southern blot. DNA-DNA hybridization with the probe to total DNA from group of bacteria ecologically similar to P. tolaasii including WLORs, fluorescent Pseudomonads isolated from oyster mushroom, P. agarici, P. gingeri, and some of other species of Psedomonas showed that some of the tested bacteria do not have any hybridized band and others have bands sowing RFLP. The cloned DNA fragment or its nucleotide sequence will be useful in detection and identification of the P. tolaasii.
느타리 세균성갈색무늬병 병원균 P. tolaasii의 전염원을 파악하기 위하여 느타리 재배사에서 사용하고 있는 물로부터 PCR방법을 이용하여 병원세균을 검출한 결과, 주로 충북지방의 느타리 재배사에서 수집된 57개 물 시료 전체의 28.1%인 16개 물에는 $m{\ell}$당 1.000 cfu 이하의 일반 세균을 포함하고 있었으며 54.4%인 31개의 시료가 1,001-10,000 cfu, 10.5%인 6개의 시료가 10,001-100,000 cfu, 그리고 7%인 4개의 시료가 100,001 cfu 이상의 세균을 포함하고 있었다. P. tolaasii의 경우 nested-PCR로 검출하였을 경우 전체의 5.3%인 3곳의 물이 Immunocapture-nested-PCR로 검출하였을 경우 전체의 35.1%인 20개의 물 시료로부터 P. tolaasii 특이적 DNA가 증폭되었다. 물에 포함된 일반세균의 농도와 P. tolaasii 검출과는 상관없었다. 이상의 결과는 물로부터 병원균을 검출하는 방법으로 IC-nested-PCR 방법이 더 민감하고 우수한 방법이며 여러 곳의 느타리 재배사에서 사용하고 있는 물이 병원균 P. tolaasii으로 오염되어 있는 것을 제시하고 있다.
시장에서 수집한 갈변병에 감염된 느타리버섯으로부터 125 균주를 분리하였고 그 중 45 균주는 병원성 균주로 조사되었다. WLFO 6 strains, WLFO 6 strains으로 나타났고, WLRO의 몇 균주는 병원성 검정 실험에서 약한 병원성을 나타내기도 했다. WLFO 6균주는 모두 느타리버섯의 갈변병 주원인균으로 알려진 P. tolaasii로 미생물 신속 동성을 (MIDI, gas chromatograph-microbial identification system)에 의해 동정되었고 WLRO는 P. gingeri, P. fluorescens biotype A and type C. 로 동정되었다. 그 외의 선발된 Pseudomonas spp.는 P. gingeri, P. agarici, P. fluorescens biotype B, P. chloroaphis, non-pathogenic P. tolaasii, P. putida biotype A, B 등으로 동정이 되었다. 분리된 병원성 세균의 세포배양 여과액으로 버섯에서의 갈변과 조직 함몰을 실험하였다. 병원성 검정에서 약한 병원성을 보인 분리균들은 갈변 또는 조직함몰이 나타나지 않았으나 강한 병원성을 나타냈던 균들은 두 현상이 모두 나타났다. P. tolaasii에 의해서 생성되는 세포외독소인 tolaasin의 활성을 조사하기 위하여 600 nm에서 용혈 활성을 측정하였다. P. tolaasii로 동정된 6 균주는 0.8∼0.9, 약한 병원성의 WLROs는 0.9∼1.0 그리고 Pseudomonas spp.는 10∼1.2로 나타났다. 공초점 현미경 기술을 이용하여 신선한 버섯에서의 조직을 optical sectioning image와 vertical sectioning image로 관찰하였고 또한 P. toiaasii에 의하여 오염된 조직부위의 영상을 회득하였다.
Tests were performed on 232 bacterial strains (71 strains of Pseudomonas tolaasii and 161 white line reacting organisms, WLRO) isolated from cultivated mushrooms. As results, P. tolaasii was divided into 5 groups on the basis of the phenotypical characteristics for the strains, and group 3 was the major one including 48 (62%) out of the total 71 strains. WLRO were classified into 23 groups, and group 10 was the major group (65 strains, 30% of the total WLRO tested). A white line was well formed at 22$^{\circ}C$ and at 4 mm distance between P. tolaasii and WLRO colonies in their dual culture on Pseudomonas agar F medium within 36-hr incubation, but not formed at $25^{\circ}C$ even for 72-hr incubation. The morphological, cultural and biological properties of P. tolaasii group 3, and the main group of WLRO, group 10, were different only in the light of pathogenicity. Also group 2 of P. tolaasii had the characteristics similar to group 24 of WLRO which was pathogenic to cultivated mushrooms, suggesting the P. tollaasiii and WLRO strains may be the same species although their white line forming ability and pathogenicity were more or less different from one another. Subculture of the strains in P. tolaasii group 1 induced the variation of their pathogenicity, white line forming ability and utilization of sodium benzoate and sodium tartrate, and thus it can be inferred that they were converted to strains having the characteristics of group 3 or WLRO groups.
Pseudomonas tolaasii 6264 균주는 버섯 조직에서 분리하였고, 갈반병을 일으키는 주요 병원균 중 하나로 확인되었다. 이 균주는 펩티드 독소인 tolaasin과 유사 펩티드를 분비한다. P. tolaasii 6264는 지난 20여년간 갈반병 연구를 위한 대표균주로 사용되었으며, 이 균주는 갈반형성능, 용혈활성, 흰색침강선형성능을 확인한 후 사용하였다. 본 연구에서는, 저장 기간에 따라 P. tolaasii 6264 균주의 특성을 비교분석하였다. 2012년 이후 저장된 P. tolaasii 6264 균주를 매년 배양하여 이들 균주의 병원성을 분석하였다. 16S rRNA 염기서열을 비교하였을 때, 모든 균주들은 두 그룹으로 나뉘어졌다. 용혈활성, 갈반형성능, 흰색침강선형성능을 포함한 균주의 병원 특성도 조사하였다. P. tolaasii 6264-15-2와 P. tolaasii 6264-17 균주는 세 가지 활성을 모두 가졌으나, 그 외 균주들은 갈반형성능만 보였으며 다른 병원 특성들은 잃었다. 각 균주 배양액으로부터 tolaasin 펩티드를 순수분리하였으며, 질량분석기를 이용하여 분석하였다. P. tolaasii 6264-15-2와 P. tolaasii 6264-17 균주는 Tol I (1987 Da), Tol II (1943 Da)을 비롯한 유사체(1973 Da, 2005 Da)를 분비하였으며, 다른 균주의 배양액에서는 이 펩티드들의 일부가 발견되지 않았다. 이러한 결과는 P. tolaasii의 병원성이 저장기간동안 변할 수 있음을 보여준다.
버섯 세균갈성색무늬병원균인 Pseudomonas tolaasii에 대한 독소저해균으로 보고된 Pseudomonas sp. HC1 균주의 배양적 특성과 최적 배양을 위한 대량배지를 선발하였다. CH1균주의 생육온도는 $20{\sim}40^{\circ}C$, pH는 5.0~11.0까지 넓은 범위에서 왕성한 생육을 보였다. 대량배양을 위한 효율적인 영양원 선발을 위하여 기본배지에 탄소원 fructose 등 18종, 무기질소원 $NH_4Cl$ 등 6종, 유기질소원 peptone 등 6종 그리고 아미노산 asparagine 등 11종을 각각 1%씩 첨가하였고, 무기염류 13종을 1 mM 농도로 첨가하여 각각에 대한 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 또한 선발된 각각의 영양성분들에 대한 최적 농도를 조사하기 위하여 각각의 성분을 0.1%에서 4.0%까지 배지에 첨가하여 배양후 생육정도를 조사하였다. 그 결과, 대량배양을 위한 생육최적조건은 온도 $20^{\circ}C$, pH5, 탄소원 0.9% dextrine, 유기질소원 1.5% yeast extract, 무기질소원 0.5% $(NH_4)_2HPO_4$, 아미노산 3.0% cysteine, 무기염류 4 mM $FeCl_3$에서 왕성한 생육을 보였다.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.