• Fisheries and Aquatic Sciences
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• 제8권3호
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• pp.118-121
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• 2005

Arylsulfatase cloned from a marine bacterium, Pseudoalteromonas carrageenovora, was over-expressed in Escherichia coli. Most of the recombinant arylsulfatase was found in the cell lysate with induction up to $10{\mu}M$ IPTG. However, enzyme activity was observed both in the culture supernatant and cell lysate by induction with IPTG concentration of $50-5,000{\mu}M$. Most of the recombinant enzyme was localized in the periplasmic space with $10{\mu}M$ IPTG induction, while half of the enzyme was distributed in the periplasmic space with $50{\mu}M$ IPTG induction. Cell growth and arylsulfatase activity did not change with the induction time, and the level of recombinant arylsulfatase expression was maintained at 4-5 U/mL after 6 to 14 hr of culture.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2003년도 생물공학의 동향(XII)
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• pp.571-575
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• 2003

A marine aerobic Gram-negative bacterium, Pseudoalteromonas carrageenovora, has been blown to hydrolyze carrageenans, the sulfated galactans of red algae, and to desulfate oligo kappa-carrageenans. Recently, the gene encoding arylsulfatase (aryl-sulfate sulfohydrolase, E.C.3.1.6.1) of A. carrageenovora was cloned and the nucleotide sequence was reported. Enzymatic hydrolysis of sulfate groups in agaropectin simplifies the process of agarose preparation. In order to overproduce the enzyme, the arylsulfatase gene (astA, 984 bp ORF) from P. carrageenovora genome was amplified by PCR and subcloned into the pET21a vector. When the constructed plasmid pAST-A1 was introduced into E, coli BL21(DE3), the transformant on LB plate containing IPTG showed the hydrolyzing activity for p-nitrophenyl sulfate. Most of arylsulfatase activity was found in the cell lysate, but at $50\;{\sim}\;5000\;{\mu}M$ IPTG concentration the activity was found both in the culture supernatant and the cell lysate. The molecular weight of the recombinant enzyme was estimated to be 34 kDa by SDS-PAGE.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제35권1호
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• pp.11-16
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• 2007

Pseudoalteromonas carrageenovora 유래의 arylsulfatase 유전자는 PCR로 증폭한 후 Geobacillus toebii의 D-amino acid aminotransferase(D-ATT) 유전자 유래의 구성적 발현 promoter를 함유하는 pHCE-IA vector로 subcloning 하였다. 4-Methylumbelliferyl sulfate가 포함된 LB 평판배지 상에서 자란 형질전환체 Escherichia coli BL2l (DE3)/pHCE-AST는 360 nm상에서 4-methylumbellifrrone에 의한 강한 형광을 보였고, 이는 대장균에서 arylsulfatase가 활성형으로 생산되었음을 의미하였다. E. coli BL21 (DE3)/pHCE-AST를 0.4% glycerol 또는 0.4% glucose가 포함된 LB 배지로 배양했을 때 arylsulfatase활성은 glycerol이 포함된 배지에서 활성이 더 높게 나타났다. 2% glycerol이 포함된 LB배지에서 arylsulfatase 활성은 약 15.0 unit/ml에 달했으며, 이는 1% glycerol을 첨가해서 배양했을 때보다 2.6배 이상의 높은 발현 수준이였다. 재조합 arylsulfatase 효소로 제조된 agarose와 시판용 agarose를 DNA markers를 이용해서 전기영동 성능을 비교했을 때 우수한 이동성과 분리능을 보였다. 본 연구의 결과, E. coli에서 과발현 생산된 arylsulfatase 효소를 이용하여 전기영동용 고순도 agarose생산 공정에 적용 가능함을 확인하였다.

• 한국생명과학회:학술대회논문집
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• 한국생명과학회 2003년도 제40회 국제학술심포지움
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• pp.102-102
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• 2003

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제43권2호
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• pp.134-141
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• 2015

대한민국 대천 해수로부터 agarase를 생산하는 균주 H9을 분리하였다. 본 균주는 16S rRNA 염기 염기서열 분석결과로부터 Pseudoalteromonas espejiana NCIMB2127^T (98.98%), Pseudoalteromonas carrageenovora ATCC12662^T (98.78%), Pseudoalteromonas atlantica IAM12927^T (98.64%), Pseudoalteromonas issachenkonii KMM3549^T (98.63%) 등과 높은 상동성을 보였다. 균주 H9은 genomic DNA 내 G+C 농도가 41.56%이고 주요 퀴논으로 quinone-8을 포함하고 있다. 균주 H9의 주요 지방산으로 C_16:1ω7c (34.3%), C_16:0 (23.72%), C_18:1ω7c (13.64%) 등이 포함되었다. 이러한 유전적, 생리적 특성에 따라 균주 H9은 Pseudoalteromonas 속의 균으로 분류하여 Pseudoalteromonas sp. H9으로 명명하였다. 균주 H9이 세포외부로 분비하는 총 agarase는 40-45℃와 pH 7.0-8.0의 조건에서 높은 효소 활성을 갖으며, agarose를 분해하여 (neo)agarotetraose와 (neo)agarohexaose를 생산하였다. 균주 H9은 한천분해를 위해 유용하게 사용될 수 있으며, 다양한 생리활성을 갖는 (neo)agarooligosaccharide는 기능성 식품, 화장품 등의 산업에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제14권4호
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• pp.777-782
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• 2004

The arylsulfatase gene (astA, 984 bp ORF) from the P. carrageenovora genome was amplified by PCR and subcloned into the pET21a vector. When the constructed plasmid pAST-A1 (6.4 kb) was introduced into E. coli BL21(DE3), the transformant on the LB plate containing IPTG showed a hydrolyzing activity for 4-methylumbelliferyl sulfate and p-nitrophenyl sulfate. The highest arylsulfatase activity (2.1 unit/ml) was obtained at 10 mM IPTG. Most arylsulfatase activity was found in the cell lysate, whereas no significant activity was detected in the culture supernatant. The molecular weight of the recombinant enzyme was estimated to be 33.1 kDa by SDS-PAGE. After the reaction of agar with arylsulfatase for 12 h at $40^{\circ}C$, the gel strength of the agar increased by 2-fold, and 73% of the sulfate in the agar had been removed. This result suggests that arylsulfatase expressed in E. coli could be useful in the production of electrophoretic grade agarose.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제37권4호
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• pp.355-360
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• 2009

P. carageenovora 유래 arylsulfatase 유전자(astA)의 효모표면발현 plasmid pCTAST(7.1 kb)를 구축하여 S. cerevisiae EBY100에 형질전환하였고, 선별된 형질전환체들을 YPDG 배지에서 배양했을 때 4-methylumbelliferyl sulfate를 분해하여 형광을 보였다. 이는 효모에서 arylsulfatase가 활성형으로 생산되었음을 의미하였다. S. cerevisiae EBY100/pCTAST를 플라스크 배양했을 때 arylsulfatase 활성은 galactose가 완전히 소모된 배양 48시간째 최대 활성인 1.2 unit/mL로 나타났으며 배양 상등액에서는 활성이 나타나지 않았다. 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase로 제조된 agarose를 agar와 시판용 agarose와 함께 ${\lambda}DNA$ HindIII marker를 사용하여 DNA 전기영동 성능을 비교 실험한 결과, agar보다는 재조합 arylsulfatase 처리로 제조한 agarose가 이동성이나 분리능에서 우수하였으며, 시판용 agarose와 비교하여 이동성이나 분리능이 유사한 결과를 확인할 수 있었다. 본 연구의 결과, 효모 S. cerevisiae의 세포표면에서 발현된 재조합 arylsulfatase 효소를 이용하여 한천으로부터 전기영동용 고순도 친환경적인 agarose 생물 생산 공정에 적용 가능함을 알 수 있었다.