• Journal of Plant Biology
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• 제38권2호
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• pp.195-201
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• 1995

본 연구는 귀리잎 기저부 절간 분열조직의 원형질체 암호흡에 미치는 ABA와 칼슘의 효과를 조사하였다. 동시에 암호흡동안 세포막내 칼슘통로 및 칼모듈린의 관련 가능성을 조사하기 위해 세포막의 칼슘통로 차단제인 diltiazem(DTZ), verapamil(VPM), 및 $LaCl_2$ 그리고 칼슘-칼모듈린 결합 저해제인 trifluoperazine(TFP)이 원형질체 호흡활성에 미치는 영향을 분석하였다. Abscisic acid 단독 처리시 $10^{-6}\;M$ 농도에서 21%의 호흡억제를 보였으며, ABA가 처리되지 않은 상태에서는 칼슘에 의한 호흡감소 현상이 거의 나타나지 않았다. 그러나 $10^{-6}\;M$ ABA 존재시 칼슘농도의 증가에 따라 현저한 호흡감소가 일어났다. 정도차이는 있었지만 DTZ나 VPM처리로 ABA와 칼슘에 의해 억제되었던 호흡활성이 회복되었으며 $LaCl_2$ 처리시에도 $10^{-4}\;M$ 농도를 제외하고는 유사한 결과를 보였고 TFP는 $10^{-6}\;M$에서 $10^{-4}\;M$ 농도범위에서 처리농도가 증가될수록 ABA에 의한 호흡억제를 회복시켰다. 이상의 결과로부터 ABA는 칼슘에 대한 agonist로서 세포막의 투과성을 증대시켜 칼슘 유입을 촉진시키고 그로인해 유입된 칼슘이 칼모듈린과 결합하여 귀리 원형질체 암호흡을 조절하는 것으로 생각되었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제22권3호
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• pp.175-182
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• 1995

벼는 임성 식물체의 재분화 뿐만 아니라 유전적으로 안정된 형질전환 식물체를 얻을 수 있는 가장 성공적인 단자엽 식물중 하나이다. 그러나 우리나라에서는 아직 유전적으로 안정된 임성 형질전환 벼품종에 대한 보고가 없었다. 본 연구에서 우리나라의 재배종인 낙동벼로부터 임성 형질전환식물체를 얼을 수 있음을 증명하였다. 현탁뱅양세포로부터 분리된 원형질체를 이용하여 PEG로 HPT와 GUS Plasmids늘 함께 형질전환시켰다. 다섯번의 실험을 통하여 hygromycin 저항성 캘러스는 평균 1.73%이였다. 소식물체는 항생제 저항성 캘러스로부터 재분화되었고 식물체 재분화효율은 약 27%이었다. 항생제에 저항성이 있는 캘러스에서 GUS 유전자가 발현되는 캘러스는 평균 35%였다. R0형질전환식물체는 성숙 개화하여 Rl 종자를 생성하였다. Rl 종자와 유모의 해부학적 GUS 활성을 분석하여 CaMV35S 프로모터 의해 GUS 유전자가 적절히 발현되는 것을 확인하였다. 또한 우리는 Rl세대에서 HPT유전자가 멘델 법칙에 따라 유전됨을 확인하였다

• 식물조직배양학회지
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• 제28권3호
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• pp.141-146
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• 2001

고추 C. anuumm, C. bacatuum, C chacoense의 하배축, 자엽 및 본엽을 원형질체 분리재료로 하여 실험한 결과, 원형질체 분리를 위해서 세포벽 분해효소로 1% Cellulysin과 0.25% Macerozyme 효소의 조합과 삼투조절제로 0.65 M sorbitol을 사용하였다. 항산화제인 MES를 효소용액에 첨가하여 줌으로써 원형질체 분리과정에서 발생하는 갈변을 억제시킬 수 있었다. 원형질체를 수정된 K8p 배지에 1∼5 mg/L zeatin, 0.5 mg/L IAA, 0.1∼0.5 mg/L TDZ, 1 mg/L 2,4-D를 첨가하여 배양하였을 때 5일에 분열을 시작하였으며 원형질체에서 얻어진 colony들을 agarose가 첨가된 반고체 배지에 고정하여 배양하는 방법이 액체평판배양 방법보다 더 효과적이었으며 이 방법은 세포배양시 분비되는 페놀류 물질로 인한 갈변을 방지할 수 있었다. 세 가지 다른 고추속의 원형질체 배양에서 얻어진 4000여 개의 캘러스를 식물생장조절제인 TDZ, IAA, 2ip, BAP, NAA, zeatin을 이용한 100가지 다양한 조합의 재분화 배지에 옮겼으나 캘러스가 커지거나 고사하는 현상만 관찰되었을 뿐 줄기로 재분화된 식물체는 얻을 수 없었다.

• 한국식품과학회지
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• 제22권6호
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• pp.611-617
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• 1990

Vitamin $B_{12}$의 생산성을 높이기 위하여 Bacillus natto와 vitamin $B_{12}$ 생산균주로 알려진 Bacillus megaterium IAM 1166 균주간의 종간 원형질체 융합을 시도하였다. 변이원 처리에 의해 활성이 우수하며 genetic marker로써 $thr^-try^-rif^r$인 Bacillus natto SH-34 및 $arg^-ade^-lys ^-str^r$의 genetic marker를 가진 Bacillus megaterium BK-13을 분리하였다. 원형질체 융합을 행하기 위하여 $500\;{\mu}g/ml$ lysozyme 처리시 원형질체 형성률과 재생률은 99% 및 67%를 나타내었다. 변이주 Bacillus natto SH-34 및 Bacillus megaterium BK-13간에 $1.0{\times}10^{-5}$을 나타내었다. 융합주 MNF-72는 vitamin $B_{12}$ 생산용 배지에서 $7.85\;{\mu}g/ml$의 높은 생산성을 나타내었으며, 융합주 MNF-72를 sodium alginate로 고정화를 하여 회분식 및 연속식 발효를 행하였을 때 72시간에 $0.58\;{\mu}g/ml.hr$ 및 $0.80\;{\mu}g/ml.hr$의 vitamin $B_{12}$를 생산하였다.

• 한국균학회지
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• 제24권2호통권77호
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• pp.111-126
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• 1996

표고 Lentinus edodes의 균사체로부터 핵을 분리하여 사철느타리 Pleurotus florida 원형질체에 폴리에틸렌 글라이콜로 전이하여 속간(屬間) 핵전이체(核轉移體)를 16균주 얻었다. 주된 핵전이주는 합핵체(合核體) synkaryon 또는 이질핵체로 꺽쇠연결체 clamp connections가 없었다. 그러나 톱밥배지를 이용하여 일정한 저온상태에서 광을 조사하여 꺽쇠연결체를 가진 균사가 다시 생장하여 사철느타리와 유사한 자실체를 형성하였으나 갓색택은 다소 달랐다. 꺽쇠연결체 형성에 영향을 주는 주요한 요인으로는 광, 온도, 배지의 영양, 배지의 생리적 상태로 나타났다. 핵치환체(核置換體) reconstituted cell는 꺽쇠연결체를 가진 표고와 유사한 균총형태로 자실체도 표고와 거의 유사하였다. 핵융합체(核融合體) nuclear hybrid는 이질배수체(異質倍數體) heteroploid로 균총생장이 빠르고 benormyl 첨가배지에서 균총분리가 나타나며 꺽쇠연결체와 자실체를 형성하지 않았다. 동위효소 esterase, leucine aminopeptidase 분석결과 핵융합체는 전혀 새로운 벤드양상이었으나 합핵체는 사철느타리의 주된 밴드를 형성하면서 양친에 없는 다소의 새로운 밴드를 형성하여 구분되었다. PCR에 의한 RAPD 벤드의 크기는 0.25-4.0 Kb였으며 유전유사도 분석으로 5군으로 구분할 수 있었는데 표고와 핵치환체, 핵합체 p669, 사철느타리와 12 핵합체, 핵융합체 p674, 핵융합체 p678이었다. 합핵체의 담자포자로 2 핵전이체를 유전분석한 결과 원영양형(原營養型) prototroph과 영양요구형(營養要求型) riboflavine으로 분리되었는데 그 비는 1 : 1, 1 : 2였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제38권5호
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• pp.387-392
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• 1995

대두 glycinin 유전자의 조직 특이적이고 분화 발달 특이적인 발현 조절 메카니즘을 연구하기 위하여 Gy2 유전자의 5' upstream 부위 염기서열을 조사한 결과, glycinin 유전자의 발현을 조절하는 인자로 여겨지는 여러 가지 조절 인자들을 발견하였다. 진핵세포 유전자에 공통적으로 존재하는 TATA box와 AGGA box가 존재하고, 종자 저장 단백질에서 공통적으로 발견되는 embryo factor binding sequence, RY repeat CACA sequence, ${\beta}$-conglycinin enhancer 와 유사한 sequence 등이 발견되었다. 이러한 조절 요소들이 Gy2 유전자의 발현 조절에 미치는 영향을 알아보기 위해 Gy2유전자의 5' upstream부위를 Exo III nuclease와 여러가지 제한효소를 이용하여 일련의 deletion mutants를 제조한 후 GUS 유전자와 결합시켰다. 이들 여러가지 chimeric constructs를 대두 원형질체에 전입하고 원형질체로부터 추출물을 분리하여 GUS 활성을 조사한 결과, $-28l{\sim}-223$ 혹은 $-l70{\sim}-122$ 부위를 포함하였을 경우 활성이 감소하였고, $-223{\sim}-170$ 혹은 $-l22{\sim}-16$ 부위를 포함하였을 경우 활성이 높게 나타났다. 이러한 Gy2 유전자의 이중적인 발현 양상은 glycinin 유전자의 발현조절에 음성 조절 요소와 양성 조절 요소가 관여하고있다는 사실을 제시해 주고 있다. 또한 이들 여러가지 chimeric constructs로 형질 전환된 담배의 종자와 잎에서 GUS활성을 조사한 결과, CaMV promoter를 포함하는 chimeric construct는 종자와 잎에서 모두 활성을 나타냈으나, Gy2 Promoter를 포함하는 chimeric constructs는 종자에서만 GUS 활성을 나타내고 잎에서는 활성이 나타나지 않는 조직 특이적인 발현 양상을 나타내었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제25권2호
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• pp.81-88
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• 1998

Southeast Asian javanica 벼 품종 Tinawen의 진탕 배양세포로부터 나출된 원형질체의 효과적인 배양과 식물체 재분화가 조사되었다. Lolium multiforum과 Oryza ridleyi의 진탕 배양세포들을 feeder cell로 사용했고 여러가지 재분화 배지를 이용하여 원형질체로부터 유도된 colony들을 재분화 시켰으며, 또한 식물체 재분화율을 높히기 위해 원형질체로 부터 유도된 colony들을 dehydration 시켜 재분화율을 조사하였다. L multiflorum 또는 O. ridleyi의 진탕 배양세포들을 feeder cell로 사용했을 때 원형질체의 평판효율은 feeder cell type과 age에 따라 차이가 났지만 0.09%에서 1.48% 범위로 나타났고, L. multiflorum을 feeder cell로 사용했을 때가 O. ridleyi cell을 사용했을때 보다 6배 높게 원형질체 평판효율을 얻었다. Feeder cell로 L. multiflorum을 사용하여 배양된 원형질채로부터 유도된 colony들을 dehydration 시킨 경우는 19.3-31.7%, O. ridleyi을 사용한 경우는 13.0-18.0%, 또한 이들 두 진탕 배양세포들을 혼합한 것을 사용한 경우는 18.0-22.0%의 식물체 재분화율을 얻은 반면에, dehydration을 시키지 않았을 때는 각각 2.0-7.0%, 3.0-5.0%, 0-4.0%의 재분화율을 얻었다. 원형 질체에서 재분화된 식물체의 flow cytometry를 이용한 배수성 분석 결과 대부분의 식물체가 이배체로 나타난 반면, 단지 34개중 두 식물체에서만이 4배체로 나타났다. 재분화된 식물체들은 온실에 옮겨 기른 결과 정상적인 임성을 나타내었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제48권1호
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• pp.34-43
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• 2021

CRISPR/Cas9에 의한 유전자 교정 기술은 유용 형질을 갖는 작물 및 임목의 육성에 있어 널리 사용되고 있는 핵심 기술이다. 유전자 교정 임목 육성에는 아그로박테리움에 의한 형질전환 방법이 높은 효율로 시행된 연구가 많았고 따라서 형질전환에 사용된 플라스미드 서열이 식물 유전체 안에 존재한다는 문제가 남아 있었다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 유전자 교정 임목을 육성하는 데 기존에 알려진 벡터 도입 기술이 아닌, 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)와 Cas9 단백질을 혼합하여 만든 리보핵산단백질을 현사시나무 원형질체에 도입하는 방법을 기술하였다. 염 스트레스 내성 관련 인자 PagSAP1 유전자를 표적으로 하는 3종류의 sgRNA를 디자인하고, 각 sgRNA와 Cas9 단백질을 혼합하여 만든 리보핵산단백질을 원형질체에 도입하였다. 표적화 딥시퀀싱을 통해 리보핵산단백질 형성 시 sgRNA와 Cas9 단백질을 혼합하고 일정 시간 배양하여 안정화되는 시간이 필요한 것을 확인하였다. 또한 sgRNA3의 리보핵산단백질이 sgRNA1, sgRNA2의 리보핵산단백질보다 높은 교정 효율을 보이는 것을 확인하였다. 본 실험을 통해 리보핵산단백질을 이용한 유전자 교정 기술이 임목에도 적용될 수 있음이 확인되었고, 이는 외래 유전자 없이 유전자 교정 임목을 육성하는 데 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국버섯학회지
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• 제22권3호
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• pp.87-91
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• 2024

버섯의 세포벽 분해를 최적화하기 위한 효소 처리에 따른 원형질체 분리 효율을 분석한 결과는 다음과 같다. 최적 삼투완충액 선발을 위해 Sorbitol, Sucrose, Mannitol, KCl을 각각 0.6M, 1.2M의 두가지 농도로 나누어 비교했을 때 0.6M Sorbitol에서 26.7±3.3×10⁷/mL로 가장 높은 원형질체 분리 효율을 확인하였다. 또한 선발된 삼투완충액과 영지 균사의 반응 시간에 따른 영향을 확인한 결과에서는 4시간 동안 반응했을 때 가장 높은 효율을 보였다. 대체 효소의 경우 endo-, exo-Chitinase의 혼합 효소인 Chimax-N을 사용했을 때 기존의 Lysing enzyme과 Yatalase에 비해 더 높은 분리 효율을 보여 원형질체 분리를 위한 대체 효소로서의 가능성을 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제39권2호
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• pp.106-113
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• 2012

Glycolysis is responsible for the conversion of glucose into pyruvate and for supplying reducing power and several metabolites. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase (AtFBA1), a central enzyme in the glycolysis pathway, was isolated by functional complementation of the salt-sensitive phenotype of a calcineurin (CaN)-deficient yeast mutant. Under high salinity conditions, aldolase activity and the concentration of NADH were compromised. However, expression of AtFBA1 maintained aldolase activity and the NADH level in yeast cells. AtFBA1 shares a high degree of sequence identity with known class I type aldolases, and its expression was negatively regulated by stress conditions including NaCl. The fusion protein GFP-AtFBA1 was localized in the cytosol of Arabidopsis protoplasts. The seed germination and root elongation of AtFBA1 knock-out plants exhibited sensitivity to ABA and salt stress. These results indicate that AtFBA1 expression and aldolase activity is important for stress tolerance in yeast and plants.