In this study, we discovered for the first time that linarin, a flavonoid compound, enhances melanin biosynthesis in B16F10 cells, and subsequently elucidated the underlying mechanism of linarin-induced melanogenesis. Linarin showed no cytotoxicity at a concentration of 42 μM and significantly increased intracellular tyrosinase activity and melanin content in B16F10 cells. Mechanistic analysis showed that linarin increased the expression of tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 (TRP-1), and microphthalmia-associated transcription factor (MITF) that are related to melanogenesis. Moreover, linarin decreased the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) and protein kinase B (AKT). Finally, we evaluated the effect of the structure-activity relationship of linarin and its aglycone on melanogenesis. The results indicated that linarin enhances the expression of melanogenic proteins by activating MITF expression via the modulation of mitogen-activated protein kinase (MAPK), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), and protein kinase B signaling pathways in B16F10 cells, thereby enhancing melanogenesis.
Eucommia ulmoides (Duchung) is commonly used for treatment of diabetes in Korean traditional medicine. However, the exact mechanism of its anti-diabetic effect has not yet been fully elucidated. In this study, the effect of E. ulmoides extract on glucose uptake was investigated in L6 rat skeletal muscle cells. E. ulmoides extract stimulated the activity of phosphatidylinositol (PI) 3-kinase that is a major regulatory molecule in glucose uptake pathway. Protein kinase B (PKB) and protein kinase C-${\xi}$ (PKC-${\xi}$), downstream mediators of PI 3-kinase, were also activated by E. ulmoides extract. We assessed the activity of AMP-activated protein kinase (AMPK), another regulatory molecule in glucose uptake pathway. Phosphorylation level of AMPK did not change with treatment of E. ulmoides extract. Phosphorylations of p38 mitogen activated protein kinase (p38 MAPK) and acetyl-CoA carboxylase (ACC), downstream mediators of AMPK, were not significantly different. Taken together, our results suggest that E. ulmoides may stimulate glucose uptake through PI 3-kinase but not AMPK in L6 skeletal muscle cells.
In vitro phosphorylation experiments with a cell extract of Streptomyces coelicolor A3(2) M130 in the presence of ${\gamma}-[^32P]$]ATP revealed the presence of multiple phosphorylated proteins, including the AfsR/AfsK kinases which control the biosynthesis of A-factor, actinorhodin, and undecylprodigiosin. Phosphorylation of AfsR by a cell extract as an AfsK source was significantly inhibited by Ser/Thr protein kinase inhibitors, staurosporine and K-252a, at concentrations giving 50% inhibition ($IC_50$) of $1{\mu}M\;and\;0.1{\mu}M$, respectively. Further in vitro experiments with the cell extracts showed that phosphorylation of multiple proteins was inhibited by various protein kinase inhibitors with different inhibitory profiles. Manganese and calcium ions in the reaction mixture also modulate phosphorylation of multiple proteins. Manganese at 10 mM greatly enhanced the phosphorylation and partially circumvented the inhibition caused by staurosporine and K-252a. A calcium-activated protein kinase(s) was little affected by these inhibitors. Herbimycin and radicicol, which are known as tyrosine kinase inhibitors, did not show any significant inhibition of AfsR phosphorylation. Consistent with the in vitro effect of the kinase inhibitors, they inhibited aerial mycelium formation and pigmented antibiotic production on solid media. On the contrary, when assayed in liquid culture, the amount of actinorhodin produced was increased by staurosporine and K-252a and greatly decreased by manganese. All of these data clearly show that the genus Streptomyces possesses several protein kinases of eukaryotic types which are involved in the regulatory network for morphogenesis and secondary metabolism.
태양광선,특히 자외선 B에 대한 환경적 노출은 편평세포암과 기저세포암을 포함하는 흑색선종 이외의 피부암과 크게 관련된다고 알려져 있다. 염기 류신 지퍼계 전사조절인자인 CChAT/enhancer binding protein-alpha는 표피 각질형성세포에서 다량으로 발현되었고, 각질형성세포의 증식을 억제하며 피부암 발생을 억제하는 유전자로서의 역할이 암시된 바 있다. 최근 자외선 B가 각질형성세포에서 p53에 의한 CCAAT/enhanrer binding protein-alpha의 발현을 강력하게 유도한다는 것이 보고되었다. 이러한 CCAAT/enhancer binding protein-alpha 단백질 발현의 유도는 세포 성장 억제 세포고사와 함께 일어났다. 이 연구는 glycogen synthase kinase-3 길항제가 자외선 B에 의한 CCAAT/enhancer binding protein-alpha 유도를 억제하며 변이 kinase-불활성 GSK의 강제 발현은 자외선 B가 CCAAT/enhancer binding protein-alpha전사조절부위 활성의 증가를 억제한다는 것을 보여주었다. 즉 자외선 B에 의한 CCAAT/enhancer binding protein-alpha의 유도가 p53과 활성 glycogen synthase kinase-3에 의한 것이라는 것을 증명하였다.
방선균은 토양속에 서식하는 그람 양성 세균으로 세포성 장의 어느 시기에 영양세포가 이어져 연쇄상의 기균사를 형성하고 그 끝에 포자를 형성하는 동시에 생리학적 분화로 표현되는 다양한 이차대사물질을 생산한다. 이들의 복잡한 생활사에 따른 분화에는 진핵생물의 ser/thr protein kinase와 원핵생물의 his/asp acid protein kinase 등과 같은 다양한 신호전달 단백질들이 조절을 담당하고 있다. Akt kinase는 진핵생물에서 보고된 ser/thr kinase로.세포내의 다양한 신호전달기구를 조절하고 있으며, 세포내의 Akt kinase의 활성화 또는 불활성화가 세포 증식, 분화, 생존, 세포사등의 신호전달에 결정적인 역할을 담당한다. 방선균으로부터 Akt kinase와 유사한 기능을 갖는 신호전달 단백질을 규명하기 위하여, Akt kinae의 target단백질들의 인산화 부위 보존영역으로부터 나타나는 아미노산의 consensus sequence를 기초로 하여 형광물질로 라벨시킨 합성 peptide(FITC-TRRSRfESIT)를 제작하였다 제작한 기질 peptide에 인산화가 일어나면 아가 로스 전기영동상에서의 운동성에 차이가 나타나고, 이를 자외선하에서 형광 peptide를 관찰하는 방법으로 인산화 assay를 실시하였다. S. griseus IFO 13350을 배양한 cell-free extract로부터 ammonium sulfate fractionation과 DEAE-Sepharose, Mono Q, Resource Phenyl-Superose, Gel permeation 등 수 단계의 column chromatography를 통하여 Akt 유사 단백질을 정제하였다. 그 결과 방선균에도 고등생 물의 Akt와 유사한 기질특이성을 갖는 인산화 단백질이 존재하는 것으로 판단되었으며, 그 중의 하나는 분자량이 39 kDa 정도의 크기를 갖는 단백질로 판명되었다. 지금까지의 인산화 단백질 연구는 활성측정법이 어려워 연구자들에게 많은 제한을 주어 왔지만, 본 연구에서 사용한 합성 peptide를 이용하는 방법을 보다 다양한 인산화 단백질에 대하여 적용한다면, 인산화 단백질 및 조절물질 개발에 많은 도움이 될 수 있을 것으로 예상된다.
Integrin-linked kinase 1 (ILK1) regulates several protein kinases, including PKB/Akt kinase and glycogen synthase kinase ${\beta}$. ILK1 is also involved distinctively in the cell morphological and structural functions by interacting with the components of the extracellular matrix or integrin. According to the information of serum- and glucocorticoid-induced kinase 1 (SGK1) substrate specificity (R-X-R-X-X(S/T)-${\phi};{\phi}$ indicates a hydrophobic amino acid), two putative phosphorylation sites, $Thr^{181}\;and\;Ser^{246}$, were found in ILK1. We showed that ILK1 fusion protein and two fluorescein-labeled ILK1 peptides, $FITC-^{174}RTRPRNGTLN^{183}$ and $FITC-^{239}CPRLRIFSHP^{248}$, were phosphorylated by SGK1 in vitro. We also identified that 14-3-3 ${\theta}\;{\varepsilon}\;and\;{\xi}$, among several 143-3 isotypes $({\beta},\;{\gamma},\;{\varepsilon},\;{\eta},\;{\sigma},\;{\theta},\;{\tau}\;and\;{\xi})$ formed protein complex with ILK1 in COS-1 cells. Furthermore, the phosphorylation of $Ser^{246}$ by SGK1 induced the binding with 14-3-3. It was also demonstrated that 14-3-3-bound ILK1 has reduced kinase activity. Thus, these data suggest that SGK1 phosphorylates $Thr^{181}\;and\;Ser^{246}$ of ILK1 and the phosphorylation of its $Ser^{246}$ makes ILK1 bind to 14-3-3, resulting in the inhibition of ILK1 kinase activity.
Protein kinase C (PKC) is a family of kinases involved in the transduction of cellular signals that promote lipid hydrolysis. PKC plays a pivotal role in mediating cellular responses to extracellular stimuli involved in proliferation, differentiation and apoptosis. Comparative analysis of the PKC-${\alpha},{\beta},{\varepsilon}$ isozymes of 200 recently sequenced microbial genomes was carried out using variety of bioinformatics tools. Diversity and evolution of PKC was determined by sequence alignment. The ser/thr protein kinases of Streptomyces coelicolor A3 (2), is the only bacteria to show sequence alignment score greater than 30% with all the three PKC isotypes in the sequence alignment. S.coelicolor is the subject of our interest because it is notable for the production of pharmaceutically useful compounds including anti-tumor agents, immunosupressants and over two-thirds of all natural antibiotics currently available. The comparative analysis of three human isotypes of PKC and Serine/threonine protein kinase of S.coelicolor was carried out and possible mechanism of action of PKC was derived. Our analysis indicates that Serine/ threonine protein kinase from S. coelicolor can be a good candidate for potent anti-tumor agent. The presence of three representative isotypes of the PKC super family in this organism helps us to understand the mechanism of PKC from evolutionary perspective.
계배 근원세포의 배양 배지에 calcium ionophore A23187이나 EGTA를 배양 24시간에 첨가함으로서 초래된 세포내 칼슘 농도의 변화는 근원세포의 분화과정에 상당한 영향을 미쳤다. 배양 24시간에 A23187이나 EGTA를 첨가한 후 배양 48시간, 72시간, 및 96시간에 각각 세포를 [35S]methionine으로 1시간 표지시킨 후 수확하여 2차원 전기영동법으로 단백질을 분리시켰을 때, 일부 단백질은 배양 조건에 따라 합성 양상을 달리함을 보였다. 배양 24시간에 처리한 A23187과 calcium-activated neutral protease는 대조군에 비해 세포융합을 촉진시켰으나 동일 시기에 처리된 phosphoprotein을 정량함으로써 조사하였을 때, A23187이 배양 초기에는 대조군에 비해 약간 이 효소의 활성도를 높이는 효과를 보였으나 세포융합이 완성된 시기인 96시간에는 대조군에 비해 활성도를 높이는 효과를 보였으나 세포융합이 완성된 시기인 96시간에는 대조군에 비해 활성도의 차이를 나타내지 않았다. A23187 및 calcium-activated neutral protease에 의한 세포융합의 촉진, 그리고 A23187에 의한 protein kinase C 활성도의 증가가 모두 근원세포의 융합이 활발히 진행되는 시기인 배양 48-72 시간에 관찰됨을 볼 때, 세포내 칼슘의 농도는 protein kinase C 및 calcium-activated neutral protease와 상호연관을 가지면서 세포분화에 관여하는 것으로 사료된다.
지금까지 각종 신경전달물질의 칼슘통로 억제 효과는 일반적으로 protein kinase 의 관여없이 G-protein mediated, membrane-delimited mechanism$^{1)}$ 으로 설명되어왔다. 그러나 최근들어 protein kinase C (PKC)의 활성화가 몇몇 신경전달물질에 의한 칼슘통로 억제효과를 야기하는 중요한 세포내 기전으로 보고되고 있다 그러므로 본 연구에서는 흰쥐 교감신경뉴론을 대상으로 하여 whole cell patch clamp technique을 사용하여 칼슘전류를 기록하고, 세포밖에 norepinephrine (NE)과 함께 PKC agonist 인 phorbol-12, 13-dibutyrate (PDBu)을 투여하면서 PDBu 전 처치로 인하여 NE 에 의한 칼슘전류 억제에 어떤 변화가 초래되는 지를 분석함으로써, 신경전달물질의 칼슘전류 억제효과시 PKC의 역할을 밝히고자 하였다. PDBu (500 nM) 처치는 칼슘전류의 크기를 증가시켰으며 이는 막전압 의존성을 보여 -10 mV ~ +10 mV 의 저분극 자극시 가장 크게 전류크기가 증가하였다. 또한 PDBu 처치는 tail current 의 deactivation을 느리게 하였다. PDBu 는 NE 에 의하여 활성화되는 pertussis toxin 예민성 G protein pathway를 통한 칼슘전류 억제를 감소시켰다. 비특이적인 protein kinase 길항제인 staurosporine (1 $\mu$M) 을 전처치 하고 PDBu를 투여하면 PDBu의 칼슘전류 크기 증가 효과가 소실되었으며 또한 NE에 의한 칼슘전류 억제를 해제하는 PDBu 의 조절효과도 소실되었다. 이상의 결과로부터 Protein Kinase C 가 활성되면 G protein을 경유하여 나타나는 칼슘전류 억제 효과가 소실된다고 결론지을 수 있다. Protein Kinase C 에 의하여 인산화되는 부위가 G-protein 인지 혹은 칼슘통로인 지에 관한 해답을 얻기 위하여는 추후 연구가 진행되어야 한다.
To investigate the difference of contractile mechanism between KCI and phenylephrine-induced contraction, we observed effects of $Ca^{2+}$ antagonists and protein kinase inhibitors on aorta contraction of rats. Verapamil dose-dependently inhibited the contraction induced by KCI and phenylephrine, the inhibitory effect of verapamil was more potent in KCI-induced contraction than phenylephrine-induced contraction. Econazole and TMB-8 significantly inhibited CKI-induced contraction but did not inhibit phenylephrine-induced contraction. Staurosporine dose-dependently inhibited both KCI and phenylephrine-induced contraction. Genistein and calmodulin antagonists (W-7 and trifluoperazine) also inhibited both contraction in a dose dependent manner. However, the inhibitory effects of genistein and calmodulin antagonists were more potent in phenylephrine-induced contraction than KCI-induced contraction. These results suggest that involvements of $Ca^{2+}$ channel and protein kinase in rat aorta contraction were dependent on agonist causing aorta smooth muscle contraction.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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