• 생명과학회지
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• 제13권4호
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• pp.505-510
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• 2003

멸치 젓갈에서 분리된 파아지의 일반적인 성질과 파아지 DNA 서열을 분석한 결과는 다음과 같다. 멸치 젓갈에서 분리된 파아지의 플라그는 대체로 작고 선명한 핀 형태로 직경 0.5∼l.0 mm이었으며, 파아지의 형태는 지름 68 nm의 대칭형 두부와 길이 100 nm의 contractile 미부를 가지고 있었고 base plate가 관찰되었다. 파아지 DNA의 크기는 약 20 Kbp 정도이었으며, DNA 염기서열은 H. salinarium 파아지 hp 32와 52.87%의 상동성을 나타내었으나 보다 정확한 분류를 위해 파아지 DNA의 전체 염기서열에 대한 분석이 이루어져야 할 것이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제21권6호
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• pp.637-645
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• 2011

Production of recombinant proteins by excretory expression has many advantages over intracellular expression in Escherichia coli. Hyperexpression of a secretory exoglucanase, Exg, of Cellulomonas fimi was previously shown to saturate the SecYEG pathway and result in dramatic cell death of E. coli. In this study, we demonstrated that overexpression of the PspA in the JM101(pM1VegGcexL-pspA) strain enhanced excretion of Exg to 1.65 U/ml using shake-flask cultivation, which was 80% higher than the highest yield previously obtained from the optimized JM101(pM1VegGcexL) strain. A much higher excreted Exg activity of 4.5 U/ml was further achieved with high cell density cultivation using rich media. Furthermore, we showed that the PspA overexpression strain enjoyed an elevated critical value (CV), which was defined as the largest quotient between the intracellular unprocessed precursor and its secreted mature counterpart that was still tolerable by the host cells prior to the onset of cell death, improving from the previously determined CV of 20/80 to the currently achieved CV of 45/55 for Exg. The results suggested that the PspA overexpression strain might tolerate a higher level of precursor Exg making use of the SecYEG pathway for secretion. The reduced lethal effect might be attributable to the overexpressed PspA, which was postulated to be able to reduce membrane depolarization and damage. Our findings introduce a novel strategy of the combined application of metabolic engineering and construct optimization to the attainment of the best possible E. coli producers for secretory/excretory production of recombinant proteins, using Exg as the model protein.

• 미생물학회지
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• 제49권1호
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• pp.99-104
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• 2013

박테리오파지 P2 sir 변이체는 그것의 위성파지인 박테리오 파지 P4를 위해 비효율적인 도움파지로 알려졌다. 이러한 현상을 "P2 sir-관련 도움파지 비효율성"이라고 부르고 있으며, P2와 P4의 cos 지역에서의 DNA 염기배열 순서 차이가 이러한 현상을 나타나게 한다고 생각되었다. 이를 검증하기 위해, 여러 단계의 in vitro DNA 조작을 거쳐 P2의 cos 지역을 함유하는 유도체 P4인 P4 sid71 cosP2를 조성하였다. 일단계 생장 실험을 통해 그것의 후손 방출량을 결정하였다. 그 결과는, P4 sid71 cosP2에서 P4의 cos 지역을 P2의 cos 지역으로 대체한 것이 "P2 sir-관련 도움파지 비효율성"을 극복한 것으로 나타났다. P2 야생형과 P2 sir 돌연변이형을 도움파지로 삼아 준비한 P4 sid71 cosP2 파지 농축액들을 CsCl 부양 균등밀도 편차실험으로 분석하였다. 그 결과, 양 경우 모두 3개의 P4 유전체를 가진 파지 입자가 우세한 것으로 나타났다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제39권4호
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• pp.337-344
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• 2011

이전 연구에서, bacteriophage ${\Phi}FC1$이 Enterococcus faecalis KBL703에서 UV induction을 통해 분리 동정되었으며, ${\Phi}FC1$은 phage attachment site인 attP와 bacterial attachment site인 attB 사이에서 site-specific integration을 촉매하는 integrase를 가지고 있다는 것을 밝혀냈으며 이를 MJ1이라 명명하였다. 이 연구에서는 이를 바탕으로 MJ1에 의한 site-specific integration의 효율을 Escherichia coli와 NIH3T3 cell에서 확인 하기 위해 attP, attB, MJ1을 각각의 벡터에 삽입하였다. MJ1 인테그라제에 의한 재조합을 수행하기 위해서 기질 벡터 pABLP를 $DH5{\alpha}$에 형질전환시킨 후, LB 배지에서 $37^{\circ}C$ 1시간 배양한 후 암피실린(ampicillin)과 테트라싸이클린(tetracycline) 항생제 플레이트로 pGMJ1과 pABLP 같이 가지고 있는 colony 들을 선별하여, LacZ 유전자가 불활성화 된 흰색 콜로니 개수를 세고 통계를 낸 결과 integration의 frequency가 99% 이상인 것으로 나타났다. 또한, 실제로 재조합이 일어났는 지를 확인하기 위해서 콜로니 PCR을 수행하여 재조합의 산물인 attL 150 bp을 확인하였다. PCR 산물은 염기서열분석을 통해 정확한 site-specific integration이 일어났음을 확인하였다. MJ1에 의한 integration을 보이기 위해 attP와 attB를 가지고 있는 vector를 MJ1 expression vector와 함께 NIH3T3 cell에 cotransfection 했으며 GFP를 reporter로 사용해 그 activity를 관찰하였다. NIH3T3 cell에서 GFP의 발현을 형광 현미경을 통해 알아본 결과, MJ1에 의한 sitespecific integration이 다른 accessory protein의 도움 없이 일어난다는 것을 볼 수 있었다. 마찬가지 방법으로, attR과 attL 간의 excision을 GFP로 알아본 결과, GFP는 발현하지 않았으며, 이는 MJ1에 의한 excision이 일어나지 않았음을 보여주었다. 이와 같은 결과로 볼 때, MJ1의 host만이 아니라 넓은 범위안에서도 integration을 수행할 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서 MJ1을 이용한 site-specific integration system의 개발은 gene therapy를 위한 gene delivery system의 구축에 있어서 좋은 시작이 될 수 있다.

• 환경위생공학
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• 제22권1호
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• pp.1-16
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• 2007

The incineration process has commonly used for wastes amount reduction and thermal treatments of pollutants as the technologies accumulated. However, the process is getting negative public images owing to matter of hazardous pollutants emission. Specially dioxins became a main issue and is mostly emitted from municipal solid wastes incineration. In this reason, pyrolysis/gasfication/melting process is presented as a alternative of incineration process. The pyrolysis/gasfication/melting process, a novel technology, is middle of verification of commercial plant and development of technologies in Korea. But the survey about the pollutant emission from the process, and background data in these facilities is necessary. So in this survey, it Is investigated that the behavior of dioxins in three pyrolysis/gasfication/melting plant (S, T, P) of pilot scale. In case of S plant, concentration of dioxins shows high at latter part of cogenerated boiler and stack which are operate on low temperature conditions than a latter parts of pyrolysis and melting furnace which are operate on high temperature condition. Concentration of gas phage dioxins had increased after combusted gas passed cogenerated boiler and this is attributed to react of precursor materials such as chlorobenzene and chlorophenol. Concentration of dioxins in T plant showed lower levels at latter part of cooling equipment which are operate with water spray type on low temperature conditions than a latter parts of gasfied melting furnace which are operate on high temperature condition. Removal efficiency of dioxins at gas treatment equipment was 78.8 %. Concentration of dioxins in P plant was low at latter part of SDA/BF which is operate at low temperature conditions than a latter parts of pyrolysis gasfied chamber which are operate at high temperature condition. Removal efficiency of dioxins of SDA/BF was 85.9 % and therefore, it showed high efficiency at those of stoker type incineration facility. However, concentration of dioxins which emitted at high temperature condition were low in three facilities and satisfied present standard emission level of dioxins. To consider the distribution ratio of dioxins, Particulate phase dioxins at S and P plants showed similar ratio with which shows in current stoker type for middle scale domestic waste incineration facility. It is necessary to continuos monitoring the ratio of distribution of dioxins in T plant in because ratio of gas phage dioxins showed high.

• 미생물학회지
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• 제32권1호
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• pp.47-52
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• 1994

Campylobacter jejuni에 48${\circ}C$의 열충격을 30분간 주었을 때, HSP90, HSP66, HSP60의 열충격 단백질들이 합성되었고, 이 단백질들은 각각 E. coli의 hsp87, HSP66 (DnaK), HSP58(GroEL)에 상응하는 단백질들이었다. 여러가지의 제한효소로 처리한 C. jejuni의 chromosomal DNA에 E. coli의 groEL(4.0kb)을 probe로 사용하여 Southern hybridization한 결과, 이들과 상동성을 가지는 유전자들이 있음을 확인하였다. C. jejuni의 groEL 유전자를 pWE15 cosmid를 이용하여 recombinant plasmid pLC1을 만들고, 이를 E. coli B178 groEL44 ts mutant에 형질전환시켜 E. coli LC1을 얻었다. 이 pLC1에는 groEL 유전자가 존재하는 5.7kb인 insert DNA가 포함되어 있었고, 그로부터 subcloning한 pLC101에는 groEL을 포함하는 4.0kb의 DNA가 삽입되어 있었다. 이 recombinant plasmid들이 형질전환된 E. coli LC1과 LC101 균주에서는 C. jejuni의 GroEL 단백질이 과다 생산되었다. C. jejuni의 groEL이 cloning된 E. coli LC1은 42${\circ}C$에서의 생장능력이 회복되었고, ${\lambda}$ vir phage에 대한 감수성도 회복되는 등의 chaperon 효과가 입증되었다.

• 치위생과학회지
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• 제7권1호
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• pp.21-24
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• 2007

본 실험에서는 S. mutans KCTC 3065을 이용하여 lactic acid를 첨가하였을 때 일어나는 스트레스 반응을 살펴보고자 하였으며 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 배지에 lactic acid를 농도별로 첨가하여 농도에 따른 생육저해현상을 조사한 결과, 배 지에 첨가 된 lactic acid의 함량에 비례하여 S. mutans의 성장이 완만해지며, 지수증식기일 때 lactic acid를 첨가 하였을 경우 유도기일 때 lactic acid를 첨가한 경우보다 균의 성장이 활발한 것을 알 수 있었다. 2. 대수증식기의 균주를 취하여 0, 60, 70, 80 mM 농도의 lactic acid를 처리한 후 colony의 생성으로 균주의 생존유무를 관찰한 결과, 70 mM의 농도로 lactic acid를 처 리하고 90분후부터는 colony의 밀도가 급격히 낮아지며생존에 영향을 받는 것을 관찰할 수 있었으며, lactic acid의 농도가 80 mM이상 에서는 생존이 거의 불가능한 것으로 나타났다. 3. Acid stress 동안에 지방산 조성의 변화를 관찰한 결과, $C_{18:1}$은 30.92%에서 33.89%로 증가하였으며 $C_{14:0}$은 5.02%에서 2.62%로 $C_{16:0}$은 39.16%에서 33.69%로 감소하였다. 4. Acid stress 동안에 단백질 패턴의 변화를 관찰한 결과, 약 70 kDa, 60 kDa, 45 kDa, 40 kDa 그리고 23 kDa의 단 백질 발현이 증가되는 것을 볼 수 있었다.

• Molecules and Cells
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• 제40권9호
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• pp.655-666
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• 2017

We constructed a large $na{\ddot{i}}ve$ human Fab library ($3{\times}10^{10}$ colonies) from the lymphocytes of 809 human donors, assessed available diversities of the heavy-chain variable (VH) and ${\kappa}$ light-chain variable (VK) domain repertoires, and validated the library by selecting Fabs against 10 therapeutically relevant antigens by phage display. We obtained a database of unique 7,373 VH and 41,804 VK sequences by 454 pyrosequencing, and analyzed the repertoires. The distribution of VH and VK subfamilies and germline genes in our antibody repertoires slightly differed from those in earlier published natural antibody libraries. The frequency of somatic hypermutations (SHMs) in heavy-chain complementarity determining region (HCDR)1 and HCDR2 are higher compared with the natural IgM repertoire. Analysis of position-specific SHMs in CDRs indicates that asparagine, threonine, arginine, aspartate and phenylalanine are the most frequent non-germline residues on the antibody-antigen interface and are converted mostly from the germline residues, which are highly represented in germline SHM hotspots. The amino acid composition and length-dependent changes in amino acid frequencies of HCDR3 are similar to those in previous reports, except that frequencies of aspartate and phenylalanine are a little higher in our repertoire. Taken together, the results show that this antibody library shares common features of natural antibody repertoires and also has unique features. The antibody library will be useful in the generation of human antibodies against diverse antigens, and the information about the diversity of natural antibody repertoires will be valuable in the future design of synthetic human antibody libraries with high functional diversity.

• 생명과학회지
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• 제19권3호
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• pp.305-310
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• 2009

플라스미드 pGKV21에는 229-nt single-strand DNA initiation (ssi) signal이 존재한다. Asymmetric PCR 기법으로 합성된 229-nt ssDNA 단편을 이용하여 실제로 RNA polymerase에 의한 priming ability와 protein interaction을 확인하였다. in vitro primer RNA 합성 실험 결과, 229-nt ssDNA 단편은 filamentous M13 phage의 주형 DNA에서와 비슷한 효율로 시발체 RNA를 합성하였으며, 이 반응은 strand-specific하게 이루어졌다. DNase I footprinting과 gel retardation 실험 결과, RNA polymerase와 SSB 단백질은 229-nt ssDNA 단편에 stable interaction을 하며, 시발체 RNA를 합성하였다. 또한, in vivo 조건 하에서 RNA polymerase의 저해제인 rifampicin을 처리하여 세포내에 ssDNA 중간체가 집적되는 정도를 비교하여 본 결과, 플라스미드 pGKV21은 rifampicin-sensitive RNA polymerase가 상보가닥 합성에 관여 함을 보여 주었다.

• BMB Reports
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• 제37권6호
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• pp.709-714
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• 2004

The wild-type repressor CI of temperate mycobacteriophage L1 and the temperature-sensitive (ts) repressor CIts391 of a mutant L1 phage, L1cIts391, have been separately overexpressed in E. coli. Both these repressors were observed to specifically bind with the same cognate operator DNA. The operator-binding activity of CIts391 was shown to differ significantly than that of the CI at 32 to $42^{\circ}C$. While 40-95% operator-binding activity was shown to be retained at 35 to $42^{\circ}C$ in CI, more than 75% operator-binding activity was lost in CIts391 at 35 to $38^{\circ}C$, although the latter showed only 10% less binding compared to that of the former at $32^{\circ}C$. The CIts391 showed almost no binding at $42^{\circ}C$. An in vivo study showed that the CI repressor inhibited the growth of a clear plaque former mutant of the L1 phage more strongly than that of the CIts391 repressor at both 32 and $42^{\circ}C$. The half-life of the CIts391-operator complex was found to be about 8 times less than that of the CI-operator complex at $32^{\circ}C$. Interestingly, the repressor-operator complexes preformed at $0^{\circ}C$ have shown varying degrees of resistance to dissociation at the temperatures which inhibit the formation of these complexes are inhibited. The CI repressor, but not that of CIts391, regains most of the DNA-binding activity on cooling to $32^{\circ}C$ after preincubation at 42 to $52^{\circ}C$. All these data suggest that the 131st proline residue at the C-terminal half of CI, which changed to leucine in the CIts391, plays a crucial role in binding the L1 repressor to the cognate operator DNA, although the helix-turn-helix DNA-binding motif of the L1 repressor is located at its N-terminal end.